|
- 积分
- 1028
- 威望
- 1028
- 包包
- 1482
|
也就是亚硫酸盐测序法，关键是设计好PCR的引物，一般为两轮的巢式PCR，甲基化是目前的研究热点，就我所做的一点工作并其中一点心得，与大家分享。希望能够对大家有所帮助。0 m& i" m$ `1 W6 u# Z e, P
第一部分 基因组DNA的提取。5 A5 {* s5 ?* W
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。
* e( u5 M/ V/ T$ @6 g8 {9 }7 R此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。. b( v7 r4 P0 J/ r2 U' G- q
使用两者的细节：5 t, k4 X4 F+ ~, |4 w
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
, ~% D) @& ^+ _, q# {# j' @2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。
- T9 S% h% @2 w( d! G! b. e验证提取DNA的纯度的方法有二：+ N9 l7 c7 E$ f+ B
1：紫外分光光度计计算OD比值；
$ s: Q& l9 J, j. q2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
" }/ R) L/ B! ^( M我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。 }; ]) {5 p) i
% {/ C# ^$ y6 B% \8 s, K! y第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
& R9 m! z& E) u# V如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
8 \ x" I( Y& t5 {( z1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；3 L; B4 y( p3 O P6 D2 M' O
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； . R5 K) u/ j) B
3： 42℃水浴30min；7 _ Y; S" G1 X7 Y- V
水浴期间配制：% r" `- g; h2 P! }. Y1 J
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）) [# m0 }+ ?' K
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
( g8 n0 ?' ?0 q6 h6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 6 U2 y7 U$ b( c, a- R* C% u
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。
& }! N5 V F9 O2 v, D, `1 P8：50℃避光水浴16h。
" K$ H4 l7 ]* E% I* O) \一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。" R; h3 M. d7 B- i/ b
这一步细节：
- b2 [7 ^, o1 r2 e1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。
, l' g, @( v2 m! }& B' [. }, L2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。
9 _% ~- A: @9 [( L3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。# [( j c; ~4 {, B* k
4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。
8 J+ Y- i t4 J `; N @& ?# f4 t) i6 u6 o# X f2 N% @/ B
第三部分 修饰后DNA纯化回收
1 m2 J; ^/ Y7 s! R# ZEP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。; s8 e- l. @% k; |6 h6 o
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。
. T) t3 [% Y3 L: \+ D2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
7 o ` E$ J6 x& ]$ ]9 i {/ _! F/ q1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；, l$ j* A' f- }; n
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；
$ a' h. G9 E R3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
# a+ c( X2 T- E- |$ ]8 C8 h4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。+ ?/ S3 l% E: t- `; H5 _
5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。
% s1 G- ]+ i m& R6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。5 t: f3 R) m. \7 x" q, c& N/ t
7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。0 P! ~$ T1 P- F4 H7 z
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。7 ?3 V: h9 \4 k- W% f$ B
4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。# [ z* W6 B3 ]3 i; `+ V
3 P" v) y6 }$ T+ H0 v+ U0 ^% F! l5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。
: [# s2 l" ^/ n3 S% o9 h6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢发表意见了）* H; E- N7 m6 A* q
7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。6 c, q Q9 }& h v% q _! a
8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。
# l% Q L1 W F# [- f; C9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul-30ulDDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。$ p: r* B, h8 v# a1 u# C
10：-20℃保存DNA溶液。. h; K+ s' A" U" R
. Y" L0 i+ w! y) F4 Y, k
此步细节：- A' H7 C3 D( w& q. A, |
1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。$ o3 s4 n3 k" Y6 Y7 j
2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。8 O- E; o" h% i7 U0 T1 Y
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。
# x9 ^7 d4 c! }: M9 _% N& q% V此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。
( i9 A9 e: s. Z+ l, ^/ c1 ^' J$ I& {! I$ ]3 Y, U- S
第四部分 修饰后DNA用于PCR8 g1 n+ S# T1 y3 Z; s' C& a; ~( Y" ~
这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：
2 L+ L$ W5 X8 O5 K$ b1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是按此行事，算比较顺利。 _4 t5 Z/ h% f- a' v2 O P
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。
! s8 O3 i: P$ z) @* d# [$ S3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。0 y, C6 m M) ~, `5 c: J1 E
4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。2 D. Y% K9 X4 ]% C0 o! |
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。
' }' v) ~) r+ E' F7 Y b3 J$ o这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验。有疑问处，请大家指出，交流。今天先到这里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分。 " i7 Z& O7 Y+ K! N) M
: i8 v3 t( P3 r. e" I第五部分 PCR产物的凝胶回收5 p# b0 X, L: `
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。
* y4 N$ @% p% R0 a/ W& y/ v几个细节：
7 V1 R. i9 {, p" P1 S: U2 f; F- O1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。3 W" N* s* |% R
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。
3 K# q7 n: `) _3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。, B8 j+ V$ Z' Q8 x* ?2 H# W$ C
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。9 g3 r2 N- T8 N! i- B
& {7 k1 N( W. s$ n# F; I- N
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
' X0 m; F, ]6 }! |1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）+ o$ w1 | F9 I# D% V5 W, X
15ul体系
0 `0 x: u, q! |, l1 oT-easy 1ul
& X0 x L3 \: |2 c7 q. oLigase 1ul + E. h# d, D/ J. H% S9 U& }: B
2xbuffer 7.5ul
+ B. W p; d: `' C9 c4 \. {9 `. RDNA 5.5ul p. {' m! E9 S7 M" _( n0 {- m/ N1 x
4度，过夜。 2 g* w# b1 u# O4 v. Z" c
2：连接产物的转化
; m3 h9 b9 j: q3 Z ]" x1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上； _/ j$ S/ \( V1 P# Z1 {
2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；& a' Q. m, h+ d) S% a
3）42度， 90秒钟；
- \+ X1 Y" _7 [+ ], W6 c4）冰上2分钟；
/ g6 j& I8 ]- V, n) _5）800ul LB培养基；
% }, [+ h1 A8 ?/ t6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；9 Q: X+ y( Y& J5 j) ?3 P: p
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
" E# G) N) m6 o9 Q! m' b8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）! f1 i9 n2 Y7 H) H$ w( c, w" u I9 W
先涂：X-gar 35ul: S, c+ w( h! A; D
IPTG 25ul ; R3 H( {/ z5 N3 L- D* x
后涂：混悬液 % B9 h- U% X4 I( S( k3 \& C2 O
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。
$ F5 w- Q$ `; o! {3：取白斑，划种于新板上
/ G7 D) \5 K" y, X0 p# W* F新板：先涂：X-gar 35ul1 ]3 h! x2 s( ^% q: b
IPTG 25ul
# B# H+ X; C6 P3 v g然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。 & ]/ k2 Z, q2 B% I$ v/ e' k3 ?
针头挑白斑划2道于板上相应区域内。) i% R. U3 v5 v7 h# o
37度，孵箱过夜。
* \5 v8 [; R8 ~6 v2 j; @5 g6 E4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。0 S3 o9 D* E# ?; Z
) i- a/ \( @" j
这一部分的细节：/ X% N1 W, Z8 o9 W# m; T
1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；6 l N* M# T" H3 s# s4 _
2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。
: j- L# ?, ?- [- S8 ?, w8 H |
-
总评分: 威望 + 5
包包 + 20
查看全部评分
|
发表于 2010-12-25 09:06
