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也就是亚硫酸盐测序法，关键是设计好PCR的引物，一般为两轮的巢式PCR，甲基化是目前的研究热点，就我所做的一点工作并其中一点心得，与大家分享。希望能够对大家有所帮助。. e1 ~4 N$ \* y2 _+ R& d
第一部分 基因组DNA的提取。% ^9 n0 W) \8 j& T9 X+ w
这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。: n P3 q6 t& H
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。
) o: V4 k- u! R7 [6 T使用两者的细节：# f1 J- z! y' D1 ^) E- Z
1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；
% E2 L3 P+ k: q5 N& G3 b& d2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。- s7 q- B+ Q& }
验证提取DNA的纯度的方法有二：
, H8 n p, I8 V1：紫外分光光度计计算OD比值；
7 [4 H- i5 J5 K2 |# G: k2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。. W D8 s' m. e
我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
, |* L, m+ p, c9 r# W: h4 x" b% N/ B$ l- E8 }8 _0 F
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
9 q+ R& _! O& z: R如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。* f. b- @3 {( R/ G _
1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；3 _+ S% E w& s% w: N7 `
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH；
! z% J5 \! O% y# c; M4 y3： 42℃水浴30min；
* b. ^0 z) d4 N2 s水浴期间配制：1 h5 [+ [- j" A* P: T9 S. ^5 I
4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）9 T& I! x+ M# ?
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。- I4 T7 c! G) U( d, U* a" k9 g! I
6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。
% G# C% H" L! H9 g4 J7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。" A" u7 p0 G7 t6 F
8：50℃避光水浴16h。
$ L9 d" H9 R# t一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。5 c7 M1 Z# N9 e$ c8 F5 x# }
这一步细节：
3 I6 _2 m: ^9 e. h9 ~% N% M1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。2 q1 m- V+ S' N% @
2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。
* D& D2 y e5 ~3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
P9 |3 T! }' s% a: ?+ G4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。 8 V3 S! r- d% b! u: q: M& |
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第三部分 修饰后DNA纯化回收6 V5 N; c3 N( V. w. }$ g
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。
* g* i! `: [$ O4 Y1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。6 N' K+ H, V* n' ~
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）8 O% v3 ]; V% F# B5 E
1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；" y8 L5 T1 K% \- s
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；
5 _1 e( O( C5 O+ v3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。1 l3 a a- Y$ q1 w' ~; \
4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。4 E# p( Q# d' H% |6 h+ q& X: h
5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。
, q* F& M/ C) e2 A) p6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。& _, X5 i8 @! Q4 f
7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。$ q+ q3 ]3 f8 s" z
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。% K7 K: x* [: \- G) `
4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。0 y0 D3 j- s1 e5 [, a+ L; f. Q
. h% ]/ z% w' A8 x/ ]
5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。( I5 [, z a3 k6 a4 z2 I2 a
6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢发表意见了）
3 A2 M- [0 i: K: C0 J& E* q7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。
# B% O0 |: B' l$ X1 W% o' V9 y8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。
$ W& n# E a& }' g+ D9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul-30ulDDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。
7 M7 Z% i& w8 t) w7 ^10：-20℃保存DNA溶液。/ G8 K! O4 J% X. P7 U0 G% D f3 N
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此步细节：" X; Q- }, c; N0 [8 N9 y4 N/ }
1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。
! L0 f7 f" ~& Z3 z* @2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。
( V% S. a( F, c* b8 ^# ]) Q) W3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。: G7 `7 N; Q- y1 l' S
此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。
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7 n0 s! p# c7 x0 s: Z第四部分 修饰后DNA用于PCR
% G: b" x8 t) B这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：; L2 j9 Y" I1 t$ s' `# F0 {9 h/ u
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是按此行事，算比较顺利。
/ Z/ L' ~0 V% E% c" r; _2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。8 n) J; U# T- b1 w6 L/ h$ P
3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。$ l5 }9 Y: l3 J4 n# M% e; ?
4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。3 Q7 V$ s, x! G. X1 o, }8 e
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。& @& j8 E4 @* R7 w* G% c8 i
这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验。有疑问处，请大家指出，交流。今天先到这里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分。
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第五部分 PCR产物的凝胶回收. R# N/ V ~5 K& C7 L. f/ [# r
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。9 M& I0 j0 v7 G& D
几个细节：( h' T% n+ E6 w" P8 I5 ]1 a% ?* o
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。7 }5 M! U, L% S! s
2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。
8 B- {7 D- W2 u; w* j3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。
8 w4 H" [* c5 I$ f0 L0 ~4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。( f! L6 f4 [, T/ }& |- o
- ^! V! O* u* s6 O1 O) ?8 q$ i
第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
2 Z" \( Z, N+ X. G7 `+ W! W/ Q4 Y1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
8 X! g7 J+ d$ Y& ]5 R+ U15ul体系
: C- U; M$ T# ]' I PT-easy 1ul
# N, O" J5 ?9 u$ t- Z+ xLigase 1ul 1 ^2 k* ?% h' H+ y! U! u
2xbuffer 7.5ul 1 ?+ j2 v c! Z1 t( O
DNA 5.5ul
8 \0 |# v5 P; O& z5 ] \% L4度，过夜。 7 Y, C% p4 P/ w, `0 H- U
2：连接产物的转化. }2 @" h! i8 R& B2 t+ }; c: M
1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；
! @1 s9 Y- G% M2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；
2 ? ~6 W/ x$ r5 f* H4 O3）42度， 90秒钟；/ Q: c2 p Z( Q) u/ G6 Q Z
4）冰上2分钟；6 g, x" P" s/ A# X& [& `6 R
5）800ul LB培养基；
' m. P# Q) ~ E& W. |( K7 ~3 u3 {6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；! z7 j' s% j; o# ~, O, c, T: I6 D
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；
0 N: m' \1 K Z8 e1 H* V2 ]8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）6 B6 R9 X. \! ?. x& Y3 t5 M, q7 s3 Q0 F
先涂：X-gar 35ul5 E5 |: M, u3 K% k
IPTG 25ul / {0 W9 T: P3 J" _* Q+ b# d: M& q
后涂：混悬液 7 C k! E; g* x- x
过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。$ b5 R- M' P% {1 [5 ~) S( `' H
3：取白斑，划种于新板上/ B- d0 m: y3 L3 I' m: v: _
新板：先涂：X-gar 35ul6 Q$ N: i8 B$ G( x' R% `; c' r0 ?
IPTG 25ul
9 X3 n! B4 a4 L7 O然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。
/ t2 }3 Y/ h6 X6 r6 |0 k针头挑白斑划2道于板上相应区域内。$ S) }9 x, i- n6 i1 V% @2 P
37度，孵箱过夜。/ N# ~' Z5 w/ L8 a
4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。! N1 B! Z q( g5 r
+ c/ }' k( A8 x- U
这一部分的细节：" @* P" d; w( h- q
1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；) {4 S; B, U: k5 C* @/ C
2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。
9 Q& a% p4 _' F! B2 G: d |
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发表于 2010-12-25 09:06
