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也就是亚硫酸盐测序法，关键是设计好PCR的引物，一般为两轮的巢式PCR，甲基化是目前的研究热点，就我所做的一点工作并其中一点心得，与大家分享。希望能够对大家有所帮助。2 {' }6 ^0 G+ W% M% K* \# K
第一部分 基因组DNA的提取。
$ s; N, s# J2 y9 ?1 ?这一步没有悬念，完全可以购买供细胞或组织使用的DNA提取试剂盒，如果实验室条件成熟，自己配试剂提取完全可以。DNA比较稳定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因组DNA应该是完整的。& n% J# l7 [6 `6 u
此步重点在于DNA的纯度，即减少或避免RNA、蛋白的污染很重要。因此在提取过程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除两者。$ C7 x1 M- L |
使用两者的细节：
5 H% z7 o% [2 h3 z3 l" ?1：蛋白酶K可以使用灭菌双蒸水配制成20mg/ml；' T' p H, F9 Z" L+ m ^2 e
2：RNA酶必须要配制成不含DNA酶的RNA酶，即在购买市售RNA酶后进行再处理，配制成10mg/ml。否则可能的后果是不仅没有RNA，连DNA也被消化了。两者均于-20度保存。! \# t3 ?, M( p: A
验证提取DNA的纯度的方法有二：
/ P" E# I# Y* j) P5 T1：紫外分光光度计计算OD比值；; l* z4 z" n/ f( t: c7 T8 S
2：1%-1.5%的琼脂糖凝胶电泳。
" f6 W- D& f( y9 [4 A! O. [我倾向于第二种方法，这种方法完全可以明确所提基因组DNA的纯度，并根据Marker的上样量估计其浓度，以用于下一步的修饰。
- \) l9 w3 _0 c C8 e$ M" S# H* x- K0 J+ `5 R& [8 }. M
第二部分 亚硫酸氢钠修饰基因组DNA
% @' ^2 K8 d5 J9 O. A# V如不特别指出，所用双蒸水（DDW）均经高压蒸汽灭菌。
2 l! w' H4 }( L3 R# A, A$ c7 _8 y1：将约2ugDNA于1.5mlEP管中使用DDW稀释至50ul；" S6 a' Z* ^4 _ u: @% Y8 |9 X3 \
2：加5.5ul新鲜配制的3M NaOH； ( e- H% c4 l" D! D1 M4 E
3： 42℃水浴30min；+ ?- c: L2 H+ t" @3 b
水浴期间配制：
8 T' M' i. N* `- K; O; B* j+ `4：10mM对苯二酚（氢醌），加30ul至上述水浴后混合液中；（溶液变成淡黄色）( ]+ A0 z* I z* N) S0 [
5： 3.6M亚硫酸氢钠（Sigma，S9000），配制方法：1.88g亚硫酸氢钠使用DDW稀释，并以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最终体积为5ml。这么大浓度的亚硫酸氢钠很难溶，但加入NaOH后会慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要准确为5.0。加520ul至上述水浴后溶液中。
+ V5 c1 E- C+ j+ |6：EP管外裹以铝箔纸，避光，轻柔颠倒混匀溶液。 . s! Y, N1 ]7 H) q4 z1 u3 h
7：加200 ul 石蜡油，防止水分蒸发，限制氧化。! l3 ]( @* ?; S* [7 l! [
8：50℃避光水浴16h。9 F0 c' J4 n7 l% Y; H6 l$ h7 T
一般此步在4pm开始做，熟练的话不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以后收，时间上很合适。
2 V/ Y0 Q0 s! Y这一步细节：
* g( X( ^5 E+ Q& m+ N0 ]) K1：基因组DNA的量不需十分精确，宁多勿少，因为在以后纯化回收步骤中会有丢失，且此方法修饰最多可至4ug。. ]. H6 ?2 T8 Y5 ]1 J' n$ C8 w- Z
2：所有试剂均须新鲜配制，所以配液的技术要过关，既要快，又要精确。
0 z' C0 C) m* B1 I& T& p" q3：亚硫酸氢钠溶液呈强酸性，一定用碱将PH调制5.0，否则PH不合适会影响后续纯化吸收。
; U5 K( f% W2 {9 J* m% x( W& l* U4：水浴最好达16小时，虽可以短至8小时，但后者修饰会有不完全。
6 e* Q! @& Y0 Z2 V6 M# i* B. B7 v% K; I# O8 |; }
第三部分 修饰后DNA纯化回收 _+ ^7 m& C) J1 V; ?4 S0 P
EP管如无特别说明均为高压蒸汽灭菌的。$ S) X4 k7 ~! b9 I- o1 X
1. 将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后吸取混合液至一洁净1.5mlEP管中。' Z: D: S' _3 J' c9 [9 `
2：以下使用Promega Wizard Cleanup DNA纯化回收系统（Promega，A7280）
( m) C4 F4 i2 W1 o( @4 Y5 D1）70℃水浴预热DDW；配制80%异丙醇；6 r4 [' L* J' J Z- P4 e
2）加1ml Promega’s Wizard DNA Clean-up resin，轻柔颠倒混匀，使DNA充分与树脂结合；
* S8 ] _$ u: I+ a' y2 y0 Y3）由于该试剂盒中仅配备针筒没有针栓，如果有真空负压吸引器，使用起来很方便；如果没有，需要自备3ml-5ml注射器。将注射器针筒与试剂盒提供的回收小柱紧密连接后，将上述混合物用移液器移至针筒内，用2ml以上的EP管放置小柱下接收废液。加针栓，轻轻加压，将液体挤出，此时可见小柱内有白色的树脂沉积。
$ ]0 c: O, E* j l4 V# o4）将注射器与小柱分离后拔出针栓，再将针筒与小柱连接，向针筒内加入2ml 80％的异丙醇，插入针栓，轻轻加压，将异丙醇挤出。此为洗涤步骤。% F$ i6 c* B+ X# Y+ G
5）将注射器与小柱分离，将小柱置于洁净1.5ml洁净EP管上，离心12000rpm，2min，以甩去残余异丙醇成分，使树脂干燥。此时，修饰后DNA处于与树脂结合状态。0 D1 L2 j# D% F; l+ c* D
6）将小柱取下置于另一洁净1.5mlEP管上，移液器加50ul预热好的DDW，室温放置5min。! t1 r2 D$ \+ R) u) O
7）离心12000rpm，20s，此为洗脱步骤，此时EP管内液体即为洗脱的修饰后DNA溶液，终体积为50ul。* n: b, |8 \# Y: T
3：加5.5ul 新鲜配制的3M NaOH，室温放置15min。- {2 ]! E' L5 ~* z
4：加33ul 10M乙酸铵，以中和NaOH，使溶液PH于7.0左右。
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2 W3 M2 B7 K/ u1 v' p& q5：加4ul 10mg/ml糖原，此作为沉淀指示剂，因为其与乙醇混合后可产生沉淀，便于以后离心后辨别回收物的位置，以防在吸取残余乙醇时将回收物吸走。其实，加入这些糖原究竟能起多大作用，不好说。不过有国产糖原卖，包装不大，也很便宜，买来一用，算严格遵守文献的步骤吧。7 r" n* t5 P# k1 E
6：加270ul 冰无水乙醇，置于-20度，过夜沉淀。有人为沉淀最短可至2小时，但我认为时间长些可能会更好。并且做到此步骤时，一般会到中午，如果样本多的话要到下午，不妨放置过夜，日程可以轻松些，顺便做些其他试验。如果想当天做完，没有问题，但我认为最好多沉淀些时候，至少6小时吧（这是经验，我做过最少6小时，也是可以的，再短就不敢发表意见了）
( y- o+ ], E; L' _! d7：4度，12000rpm离心，30min，倒去上清液，收集沉淀。不必吸净。
' y* C' l" f0 h2 t# N8：加500ul 70%乙醇，不要将沉淀吹打起来，只要把乙醇加上即可。轻柔倾斜EP管，旋转一圈，再次离心，4度12000rpm，5min。离心后倒掉上清，再加同量乙醇，同样再做一遍。此为洗涤步骤，共2次。. b# g( K. e. a9 H% o
9：倒掉上清，并常温简短离心后，将附壁乙醇离至EP管底，移液器小心将残余液体吸净，室温干燥5min，或沉淀由不透明变为半透明或透明时，加入20ul-30ulDDW，溶解沉淀。至此，已完成了修饰后DNA的纯化回收，所得为修饰后DNA溶液，可用于此后的进一步实验。
+ k2 W t) q( [& J10：-20℃保存DNA溶液。: D% C5 Y8 j4 |. Q
3 ? ]" t6 C) B D+ S* N" F此步细节：* N& l) g; o8 `5 ?
1：在使用注射器时，一定要用力均匀且轻，如使用暴力，会将小柱内的薄膜挤破，失去作用。
) ]- d% ^& T' j4 l2 j& }0 z2 T' P2：乙酸铵、糖原不需新鲜配制，糖原配好后放在-20度保存，乙酸铵室温即可，因为这样浓度的乙酸铵非常难溶，一旦放在4度，取出用时也会有很多溶质析出。+ i1 p0 Z7 f# ]$ a0 U g
3：异丙醇、70%乙醇都不需要新鲜配制，但如果用量大，现场配也很方便。
4 m. L& Z F: i$ _! V" i! u此步关键是在树脂与DNA的结合上，这就再次强调第二部分调亚硫酸钠PH值得重要性。因为树脂与DNA结合需要有一个适当的PH，如前一步没做好，此步树脂不能与DNA很好结合，将会带来灾难性后果，即DNA随着液体被挤出了，洗脱时实际已没有任何DNA了。; r; _" w! w3 I& G+ @3 b
- I- p N" c0 G% Q8 V第四部分 修饰后DNA用于PCR
5 H) v" E: \+ l4 i H% ^这一步也没有悬念。我主要谈一下这里面的几个比较棘手的问题：) ?) D6 ]& |) M- e8 D7 ~' u/ i1 o
1：引物问题：我感觉自己设计引物有相当的难度，我曾设计过几对引物，并且试验了一下，但以失败告终。如果时间充裕、作的又是比较新的基因文献不多，自己设计引物没有问题。如果不是这样，还是参考文献更好些。首先查阅SCI分值高的文献，然后是著名实验室的文献，如果国内有做的，更好了，可以直接联系咨询。查到序列后，一定要和Genbank中的序列进行比对，防止有印刷错误造成的个别碱基的差别。然后再到google上搜一下，看用的人多否，体系条件是否一样。用的人多、体系条件一样，表明可重复性比较强。我也是按此行事，算比较顺利。! L: L6 ~0 |" t! R
2：Taq酶问题：有文献用高保真的金牌Taq（Platinum），但我感觉只要体系正确、变性退火等条件合适，一般的热启动酶是可以的。我开始使用的是Takara的LA Taq，很好用，配有10x含mg++的LA缓冲液。有时候用没了，暂时以Takara 的普通Taq酶也可以。如何选择，可以根据自己的情况。初作者还是用好一点的酶。
# ?) W# h9 T. P. R& J3：PCR的条件：变性一般都选择95度，3min。其余我感觉还是根据文献，退火可以根据你的引物的退火温度在小范围内尝试。一般和文献报道差别不大。只是扩增片断特异性的问题。建议根据文献。
: L* x# T3 f6 K" k4：做PCR的EP管最好选择进口的，壁薄且厚度均匀，这可以保证温度的迅速变化可以及时传递给管内的反应液，使体系真正在所设定的温度下运行。) V' _- k6 M# r. [6 w! f
5：PCR仪：如果在某一个仪器上作出来了，最好一直用此仪器继续。不同的仪器“脾气”也不一样，但EP管必要和仪器内的插孔紧密结合方好，留有空隙，我认为会影响温度的传递。1 [( J1 l5 S9 p6 P- p. L# ?
这一部分有些啰嗦，只是个人一些不成熟经验。有疑问处，请大家指出，交流。今天先到这里，现写一些内容，比较费劲，总是不能一挥而就。望见谅。歇息一会准备写最后蓝白斑筛选克隆这一部分。 8 A. e( o$ A) b4 D
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第五部分 PCR产物的凝胶回收1 ?$ h4 y3 Y$ \# ?
这一步比较简单，可以购买一个凝胶PCR产物回收试剂盒，国产的就很好、价格也合理，比如TIANGEN的产品（用过）。把切下来的胶按说明书操作即可。 w- ^. n2 T4 C; j
几个细节： K/ v8 C0 ?/ z. a6 n: Q
1：PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，要使用新配的电泳液。凝胶浓度1%-2%均可。
2 q( _8 `6 a) V" E& G" T2：凝胶DNA回收时在300nm紫外灯下观察条带位置，切取目的片断所在位置的凝胶，尽量小，保证特异性。
* |! H+ D0 O, D' j# j2 T3：紫外照射时间不能过长，否则对DNA有损伤。; a# J, X; t" u$ e
4：回收后的DNA如不马上用就储存于-20度，在数月内是很稳定的。) \! C' f8 ?' o# j1 ^
0 W- Z' Y3 K* J; Q5 G3 Q第六部分 PCR产物与T载体的连接和转化、蓝白斑筛选
$ m! L9 i7 y5 `+ X" O1：连接T载体（本实验使用的是Promega的试剂盒）
* b: F0 B3 E# i( b! s/ |- [15ul体系1 m; S- `3 S* F/ U0 @
T-easy 1ul" |0 T4 P& `5 S7 [. y
Ligase 1ul 7 S* U9 Z6 v% d+ b, j
2xbuffer 7.5ul ' i+ x ?/ `8 y7 W
DNA 5.5ul
1 i2 I+ |- |* b* ?4度，过夜。 A; T2 n& u" t" i5 [/ B2 C
2：连接产物的转化
% }0 b( C8 b! F0 ]9 H( ~4 l1）-70度冰箱内取出感受态细菌，融化后置于冰上；
- ^1 C7 ~" _4 k& B" Z0 v, k& Y2）连接产物15ul 全部加入，至于冰上30分钟；4 _; T) @, o1 [8 b2 ~! E+ t
3）42度， 90秒钟；6 E( Z) I' M* ?4 h# Z$ n0 g' ^
4）冰上2分钟；8 L. w n4 I; l. [$ x
5）800ul LB培养基；
1 K3 g) P' M2 n; e5 c9 I6）280rpm，37度，摇床45分钟（将管放水平了摇，保证菌液摇匀）；9 T! R2 }' V2 V( h
7）8000rpm，1分钟；在超净台内去上清，留100-150ul；9 z( Y3 T' W- `% ]8 s/ n
8）涂板：37度孵箱过夜；（板为含有氨苄青霉素的固体LB培养基）
# a& p7 Z8 c4 p5 t! ]/ Y) O先涂：X-gar 35ul$ T# a- \8 V6 P, N4 ?
IPTG 25ul
9 m: ?8 c" ?% y) B8 ^ z1 {& w后涂：混悬液
3 ?8 X7 U$ ]4 [3 D" v过夜后可见板上长出很多蓝色或白色斑点，取白色斑点，尤其是蓝色斑点周围的白色斑点，此处自联率较低。% M1 b: g$ l- e. R+ c6 x8 u5 g
3：取白斑，划种于新板上
: d+ |) a ~* G! g' d% E新板：先涂：X-gar 35ul5 Y0 g) o% z' J7 W& X, C/ ]" z
IPTG 25ul 1 V7 g$ v9 e! ]; J$ ]
然后于板底划出分区，进行标记。根据需要，一般一板作50个克隆没有问题。
' A [( l( G# y6 s) |' R. C针头挑白斑划2道于板上相应区域内。5 a9 @5 x- \/ N- M6 n# r2 @& L
37度，孵箱过夜。
% X) x/ X1 X9 r4 n5 [4 B4：联系测序公司送测序。一般一个克隆在35-45元。
; z2 c' Y# t( f: f" }0 S* n: f0 a- w8 E/ S
这一部分的细节：9 w- u% \3 M. x, _
1：涂板要均匀，保证Xgar和IPTG均匀分布在板面上；' z) j2 z6 V. n+ a2 D
2：不要让蓝白斑长得太满，否则选取克隆时容易一下挑2个。
+ q: \4 L d; M. a |
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发表于 2010-12-25 09:06
