求助关于肿瘤干细胞微球体的传代

cookiezhang

肿瘤细胞在无血清培养基中形成微球体之后，传代的时候要用胰酶-EDTA先消化，吹打形成单细胞悬液，然后离心，之后重悬分装吗？是这样做吗？9 U: K  }* H5 Y$ x
大家都要用胰酶-EDTA消化吗？

深海寂寞鱼

to cookiezhang：
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肿瘤干细胞的微球体或者说肿瘤球的传代过程大概是这样的：
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; x; r" D2 |5 M3 b$ Y& v1 ?1. 离心收集肿瘤球：300g ， 5min% j$ ]8 @, @1 j
2. 弃掉培养基，用PBS重悬肿瘤球5 y& c7 E* W- ^2 R, F; I
3. 离心后弃掉PBS
* y/ L' q/ M$ m, v0 }9 c. D4. 胰酶－EDTA重悬，消化肿瘤球（一般 37度，5min；可根据经验调整时间）。每1-2分钟，用手指Tap离心管底部，使细胞悬浮。" }, ^$ u; m% m# V" X+ C
5. 加入培养基终止消化，适度吹打使细胞进一步分散
6 H* G, G# L' l0 e1 R6. 离心后弃掉上清，培养基重悬，按适当密度接种。
* i1 T  Q& l5 {; O4 P
. e3 v! B; E; v8 l) U这只是一个大概的操作过程，其中的每一步都可以根据自己的经验，尤其是自己的细胞状态，进行相应的调整。
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. [+ E/ V- r% `( b+ G我现在基本上用Accutase代替胰酶－EDTA消化肿瘤球了。主观上感觉损伤好像能小一些。但是胰酶－EDTA绝对是可以用。
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你先按照这个流程试试看。如果有什么问题可以再交流。

cookiezhang

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非常感谢深海寂寞鱼。

cookiezhang

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2 Z9 C9 A( G. Q6 j1 k8 O6 D. H" Z+ e1 Q4 [' F
想请教深海寂寞鱼：培养细胞球用的细胞因子EGF、bFGF，你用的是什么公司的，是直接分装就可以用的，还是有干粉自己配制的，哪种比较合适啊？

深海寂寞鱼

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6 {8 s$ V8 l$ X/ y, a9 G6 d' Eto cookiezhang：
9 \/ T& c, ?. M2 H* J; |! Q! v7 D. J9 b5 T  z: K9 D
    我用的EGF和bFGF都是Peprotech公司的。都是干粉。自己配制后使用。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子9 O  Z7 }6 N& O* i* _1 P! d

6 `9 L9 W0 D0 j5 v3 n请教下深海同学 有师兄建议我的无血清培养中除了EGF bFGF 还添加白血病抑制因子 不过我看白血病抑制因子是促进细胞分化的呀 而且像胰岛素这些需要吗？还是只是EGF bFGF B27加两抗就行了？

深海寂寞鱼

to jamquit：请问你打算培养什么细胞？然后我才可能稍微准确的回答你的问题。
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9 |' A+ T5 @; W* O1 B+ V- ^7 C
另外，有个小建议：希望你能自己多看文献。因为任何人给你的建议都是从自己的主观出发的，适不适你，你自己必须学会判断。
; }! p- I" h" S& K+ _9 {  \6 e8 b* \6 r
+ ?) N( Q0 @( R6 f4 q而判断的标准一般需要从你读文献中获得。; E# _6 m2 f2 H* p5 [) @3 t5 r

4 W+ D8 q2 v2 i2 Y3 t9 w比如，你师兄建议你不加EGF和bFGF，你就可以问问他不加的原因是什么？有什么好处，有什么缺点。加入LIF又有什么优点，可能带来什么不足？# }5 t) e+ w! Q7 g. A* f

& T. `3 Z5 F2 X; w# o再进一步，你应该通过查找资料明白EGF、bFGF，LIF它们各自可能的作用是什么。
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* @. ?! K0 b" \; w# N' y3 |8 {只有这样，你后面的实验才可能很好的开展。
( D! g( f# ~; B: o1 X* h
9 O) w4 J2 T4 Q8 _5 G% R个人的深刻感受，与你分享。希望你能明白。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子: E. ?( p1 _$ ?( b5 S+ n' v: ~

# O* }2 j; v. P/ j/ x恩恩 谢谢~~~~等我再多看点儿文献了再找你探讨吧~~

lh_kitty

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你好，请问你培养的是什么肿瘤干细胞？我现在在养食管癌细胞，用无血清培养基养出来的细胞总是有贴壁的，传了几代之后还是有悬浮有贴壁的，不知怎么解释，想请教一下你在养细胞的时候是否遇到这种情况？

深海寂寞鱼

to lh_kitty：这种问题当然经常遇到啦。
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                我养过几种肿瘤的原代组织，但是确实没有养过食管癌组织。6 k+ e4 G1 j# l/ ~) k- q4 O8 D8 ^+ O  W

/ h' `( J" u) D& Z6 k# x$ H1 q0 H                就我的经历来看，胶质瘤的原代组织会乖乖的长成悬浮的肿瘤球，贴壁的较少。
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/ v* J* u2 ?0 L) A: Q% q5 }                其它的肿瘤都有不同程度的贴壁，有些会比较严重。: S: E# A  ^& R! q% B
- T, t5 F5 M0 x) E4 ?8 Y; N
                论坛里对于这个问题，大家也都有提到。解决的方法或者说改善的方法，大概有：
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, p8 v1 K5 a2 O( ~                1. 如果实验室条件允许，尽量用超低粘附的皿来进行培养。$ ~% n0 y. r# ^0 p; \7 I5 [. C
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                2. 控制细胞的接种密度，稍微稀一点。
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                3. 多加一些培养基。% e1 i# S7 y! s9 \# ?

# z' ~4 T8 M0 I  R               你可以按照上面的方法试试看，个人觉得你是不是细胞接种的比较密。! Q5 r) w, D8 K1 a% ^. y4 J) I
! p! V* G% e7 b; ^' W
               当然我一向的观点都是尽量多看这领域的经典文献，从中找到解决问题的方法。
% m" G% U: q$ W4 K; w3 O
5 c7 o9 P& }7 E, a1 O: D) f               如果你认为悬浮状态的是你需要的细胞，传代时尽量轻轻的吸取培养基进行传代，贴壁的暂时可以考虑舍弃。
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       你问我对于这个问题的解释。说实话，我还没有太想明白。  1 u- g2 T4 n( e# v! w+ J, b

# B5 Z) L+ P- D0 e/ B, @       但是通常会认为贴壁的细胞可能是分化了的或者开始分化的细胞。我还在观望中。