求助关于肿瘤干细胞微球体的传代

cookiezhang

肿瘤细胞在无血清培养基中形成微球体之后，传代的时候要用胰酶-EDTA先消化，吹打形成单细胞悬液，然后离心，之后重悬分装吗？是这样做吗？
7 a; p6 N% J* w1 f0 z+ I/ w 大家都要用胰酶-EDTA消化吗？

深海寂寞鱼

to cookiezhang：
2 ^# @9 [3 N5 Z% _  g+ [$ ^7 b2 ]) G8 m5 _
肿瘤干细胞的微球体或者说肿瘤球的传代过程大概是这样的：
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1. 离心收集肿瘤球：300g ， 5min
' H6 j% f; N2 s7 x0 a! @2. 弃掉培养基，用PBS重悬肿瘤球
% d1 T4 t) H2 h( g) E% Z9 S( m3 b3. 离心后弃掉PBS
: j" N1 B, R1 @1 F3 X/ m6 z3 @4. 胰酶－EDTA重悬，消化肿瘤球（一般 37度，5min；可根据经验调整时间）。每1-2分钟，用手指Tap离心管底部，使细胞悬浮。
$ k- S& u9 ]4 b2 u; l0 F- D5. 加入培养基终止消化，适度吹打使细胞进一步分散
3 \9 n# `: N, j7 H" y- w6. 离心后弃掉上清，培养基重悬，按适当密度接种。
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0 P! x5 o! A1 o0 l  F+ f2 r% A. R- N这只是一个大概的操作过程，其中的每一步都可以根据自己的经验，尤其是自己的细胞状态，进行相应的调整。
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; c! K% r% |- y4 _) F我现在基本上用Accutase代替胰酶－EDTA消化肿瘤球了。主观上感觉损伤好像能小一些。但是胰酶－EDTA绝对是可以用。! s: z% o" ?1 ^: ]
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你先按照这个流程试试看。如果有什么问题可以再交流。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子! S7 |  |# K: A/ D7 k8 z

9 N. R  L& {& ~. a9 Y' c4 ^非常感谢深海寂寞鱼。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子
1 Q! r3 f% t1 n  k9 n) E) `' _' _: s; @5 `$ {0 O/ K1 @3 Z
想请教深海寂寞鱼：培养细胞球用的细胞因子EGF、bFGF，你用的是什么公司的，是直接分装就可以用的，还是有干粉自己配制的，哪种比较合适啊？

深海寂寞鱼

回复 cookiezhang 的帖子2 R1 e. @; B  E4 y! l9 \0 R2 {1 ~

8 G7 v# y: F5 o% s; ?6 b$ V9 oto cookiezhang：
: J6 x2 ^7 B# \4 T0 Y( W
( G% p. d- {; ^2 V0 W+ m    我用的EGF和bFGF都是Peprotech公司的。都是干粉。自己配制后使用。

jamquit

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/ h. e& D; @9 ^- `$ f* x" O) R. V+ G  f1 X! j
请教下深海同学 有师兄建议我的无血清培养中除了EGF bFGF 还添加白血病抑制因子 不过我看白血病抑制因子是促进细胞分化的呀 而且像胰岛素这些需要吗？还是只是EGF bFGF B27加两抗就行了？

深海寂寞鱼

to jamquit：请问你打算培养什么细胞？然后我才可能稍微准确的回答你的问题。9 h6 w: K+ s/ {$ n+ l( s( W

, w2 x- C* @" c& `- x3 b8 `" c7 d. e1 f' d& r+ \8 b4 E
& N. \7 b( e1 c$ v! U
另外，有个小建议：希望你能自己多看文献。因为任何人给你的建议都是从自己的主观出发的，适不适你，你自己必须学会判断。
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而判断的标准一般需要从你读文献中获得。5 X& T  D; _! e; C- T7 E3 [

0 F3 z( f1 ~& C+ l8 }0 _比如，你师兄建议你不加EGF和bFGF，你就可以问问他不加的原因是什么？有什么好处，有什么缺点。加入LIF又有什么优点，可能带来什么不足？2 r  n% P/ E) W, t2 E* s
: z2 w: z9 r) `6 S+ }, i* F
再进一步，你应该通过查找资料明白EGF、bFGF，LIF它们各自可能的作用是什么。
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! |( M" T' b- v4 U4 v' h. H" Z' J. V只有这样，你后面的实验才可能很好的开展。
; r+ y0 F! \' o% R
' m0 `( X. D/ ~个人的深刻感受，与你分享。希望你能明白。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子7 H+ Z" ]& k& A3 a  s0 ^# n
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恩恩 谢谢~~~~等我再多看点儿文献了再找你探讨吧~~

lh_kitty

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$ T" u7 F  Q; m, `$ ^# ]" y1 R- ~2 v: L
你好，请问你培养的是什么肿瘤干细胞？我现在在养食管癌细胞，用无血清培养基养出来的细胞总是有贴壁的，传了几代之后还是有悬浮有贴壁的，不知怎么解释，想请教一下你在养细胞的时候是否遇到这种情况？

深海寂寞鱼

to lh_kitty：这种问题当然经常遇到啦。
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" K0 |( ]- m* U& h5 {- G                我养过几种肿瘤的原代组织，但是确实没有养过食管癌组织。
, q! h! ?& f! B* X; r, I1 l* d( O) e5 h- t6 B: ?
                就我的经历来看，胶质瘤的原代组织会乖乖的长成悬浮的肿瘤球，贴壁的较少。9 P8 o; A, `" V* @6 U
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                其它的肿瘤都有不同程度的贴壁，有些会比较严重。3 @2 y3 X0 ]4 N  x& I8 c& p
4 C) J8 I' ]# G, y
                论坛里对于这个问题，大家也都有提到。解决的方法或者说改善的方法，大概有：
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: W6 N6 K/ F, k$ O% M. P: e                1. 如果实验室条件允许，尽量用超低粘附的皿来进行培养。
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                2. 控制细胞的接种密度，稍微稀一点。+ D9 G2 J+ L* Q& }
" z  K# |+ a% }( H/ j5 S# E' `
                3. 多加一些培养基。- z2 M& E: L$ P
6 c0 q  K$ m; k+ d: e
               你可以按照上面的方法试试看，个人觉得你是不是细胞接种的比较密。5 d& u( t  e+ n. x3 D

2 W0 m  X* d& ]9 H               当然我一向的观点都是尽量多看这领域的经典文献，从中找到解决问题的方法。
6 J) G4 y! X0 r1 x+ G% s" [8 x; I, s% N
               如果你认为悬浮状态的是你需要的细胞，传代时尽量轻轻的吸取培养基进行传代，贴壁的暂时可以考虑舍弃。
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- a/ c2 m& C) N( n" [& g9 Y! R       你问我对于这个问题的解释。说实话，我还没有太想明白。  & E& E$ g" ?( N( w
" R/ ^& l) q' N! c1 j# l
       但是通常会认为贴壁的细胞可能是分化了的或者开始分化的细胞。我还在观望中。