求助关于肿瘤干细胞微球体的传代

cookiezhang

肿瘤细胞在无血清培养基中形成微球体之后，传代的时候要用胰酶-EDTA先消化，吹打形成单细胞悬液，然后离心，之后重悬分装吗？是这样做吗？
/ X4 h' C$ C9 y/ R+ _2 N 大家都要用胰酶-EDTA消化吗？

深海寂寞鱼

to cookiezhang：8 q" d" y( y( k8 U/ M# Z# ~* t5 [

" J  a* b2 b  y, p5 G( s2 M3 Y! J肿瘤干细胞的微球体或者说肿瘤球的传代过程大概是这样的：
3 [/ d  F" x6 b- Z4 E
2 x/ e$ F  n$ r" [- u" s* R" M$ p1. 离心收集肿瘤球：300g ， 5min; p, W, L7 r! [; U3 Y9 c
2. 弃掉培养基，用PBS重悬肿瘤球
" G' N2 f3 I$ J5 W: P3. 离心后弃掉PBS! P" U1 D6 B& Z/ q
4. 胰酶－EDTA重悬，消化肿瘤球（一般 37度，5min；可根据经验调整时间）。每1-2分钟，用手指Tap离心管底部，使细胞悬浮。
7 k0 S' [3 X' G" P0 ^: R( e5. 加入培养基终止消化，适度吹打使细胞进一步分散0 h% F& z: j* p" u& @# u
6. 离心后弃掉上清，培养基重悬，按适当密度接种。$ I3 n$ N) S* v
) }, ?4 `7 D$ @# q8 v5 Y4 [1 y
这只是一个大概的操作过程，其中的每一步都可以根据自己的经验，尤其是自己的细胞状态，进行相应的调整。
0 x& u- L" u: R& i* f" G- l8 G$ @
) M* E2 H+ M2 @- T9 O我现在基本上用Accutase代替胰酶－EDTA消化肿瘤球了。主观上感觉损伤好像能小一些。但是胰酶－EDTA绝对是可以用。
7 y( Y5 x' Y& T+ l2 m( M; z- M% t, Z# ~
你先按照这个流程试试看。如果有什么问题可以再交流。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子: g0 H8 Z( C# }4 `/ S) R

! p6 U9 {- {) n+ A( v; Q8 M5 H9 _9 u非常感谢深海寂寞鱼。

cookiezhang

回复 深海寂寞鱼 的帖子2 Q1 P6 @# ~- D" L+ t+ F

- s6 F- ^6 R- \5 v; T1 O) D" t' X) b! A想请教深海寂寞鱼：培养细胞球用的细胞因子EGF、bFGF，你用的是什么公司的，是直接分装就可以用的，还是有干粉自己配制的，哪种比较合适啊？

深海寂寞鱼

回复 cookiezhang 的帖子9 `! T! N8 N% L- J' h) m

/ |, Y* r5 a( R( \to cookiezhang：6 o6 Q4 c1 N! {1 H

) X( ?$ P- {8 y5 E. G  v    我用的EGF和bFGF都是Peprotech公司的。都是干粉。自己配制后使用。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子
# o, p0 _, {0 E. u5 K  f- v
% ^* E  v: Y% x. U5 }6 T# K( k请教下深海同学 有师兄建议我的无血清培养中除了EGF bFGF 还添加白血病抑制因子 不过我看白血病抑制因子是促进细胞分化的呀 而且像胰岛素这些需要吗？还是只是EGF bFGF B27加两抗就行了？

深海寂寞鱼

to jamquit：请问你打算培养什么细胞？然后我才可能稍微准确的回答你的问题。
' ?, ?" ~* T/ R; w8 {( X; u6 b% @& x# G% O% \: |

1 @$ F- O$ v- r1 A: O! g$ Y8 V8 a* ~& Q# e
另外，有个小建议：希望你能自己多看文献。因为任何人给你的建议都是从自己的主观出发的，适不适你，你自己必须学会判断。
2 X- F% U$ q3 O$ ]4 ^/ w" {* g+ b+ W; G6 X) u* `3 w3 o
而判断的标准一般需要从你读文献中获得。$ R: ^) ^% \! m' {

( E7 ~. y6 I# Y比如，你师兄建议你不加EGF和bFGF，你就可以问问他不加的原因是什么？有什么好处，有什么缺点。加入LIF又有什么优点，可能带来什么不足？
8 y  I2 y3 n) }" W& x+ O4 x$ G) t+ `/ Q8 p6 u& _
再进一步，你应该通过查找资料明白EGF、bFGF，LIF它们各自可能的作用是什么。3 H; k' {: R  O! j# m
0 {! d! m' x+ N8 ]1 d$ n6 t, z
只有这样，你后面的实验才可能很好的开展。. s! J' k# j* O5 G% U- J  l& R& ]6 O
- O/ Z* {9 t. J4 p. ~
个人的深刻感受，与你分享。希望你能明白。

jamquit

回复 深海寂寞鱼 的帖子
: b  z/ M4 z5 p% T* ^  w  F. S5 }: P: B8 z+ x. P" N. I. Q! l
恩恩 谢谢~~~~等我再多看点儿文献了再找你探讨吧~~

lh_kitty

回复 深海寂寞鱼 的帖子  k2 o1 ?# g- K, V

" h& U! {, ]$ Q: {; ?5 _& `) r你好，请问你培养的是什么肿瘤干细胞？我现在在养食管癌细胞，用无血清培养基养出来的细胞总是有贴壁的，传了几代之后还是有悬浮有贴壁的，不知怎么解释，想请教一下你在养细胞的时候是否遇到这种情况？

深海寂寞鱼

to lh_kitty：这种问题当然经常遇到啦。
* r; `1 ~, g) f2 m) _
, w9 T, k+ G7 X' n                我养过几种肿瘤的原代组织，但是确实没有养过食管癌组织。( _4 h; T1 ~( ?' u
7 ]. D8 q' G! V1 B
                就我的经历来看，胶质瘤的原代组织会乖乖的长成悬浮的肿瘤球，贴壁的较少。2 O% Z: b$ X2 `

( [: }; `8 b) q/ T8 ^                其它的肿瘤都有不同程度的贴壁，有些会比较严重。0 [" f1 n% C0 F: Q/ |
- j+ R+ X  x, T4 {  B7 \  f6 n3 R
                论坛里对于这个问题，大家也都有提到。解决的方法或者说改善的方法，大概有：0 [! O- }( H* ^' c

! J% f1 X6 j3 K8 B  V' C% X+ n5 \                1. 如果实验室条件允许，尽量用超低粘附的皿来进行培养。
$ u. `, b0 G: s1 L. X& w2 E: V0 a$ I; M6 }6 ]  `4 y
                2. 控制细胞的接种密度，稍微稀一点。
* |/ Y' N% ^4 f0 Q9 B
- z! M1 l* {; P+ ~2 n                3. 多加一些培养基。, X) o$ I% c" j1 o, x# e

0 P2 Z9 z% p9 v3 W: G               你可以按照上面的方法试试看，个人觉得你是不是细胞接种的比较密。- @; |" i9 _  {' X5 O
8 w8 f9 J  u, D& }- V
               当然我一向的观点都是尽量多看这领域的经典文献，从中找到解决问题的方法。
% J9 H) G) u( X& ]/ Y8 A2 i7 ]7 X. ]/ f7 ~; E" e+ h
               如果你认为悬浮状态的是你需要的细胞，传代时尽量轻轻的吸取培养基进行传代，贴壁的暂时可以考虑舍弃。
! X# R6 X* l& V* ~. q4 s9 j0 |9 r( i3 K8 m9 h" n; i4 X4 c
       你问我对于这个问题的解释。说实话，我还没有太想明白。  6 K7 E7 q0 b0 z" o% W2 N2 @& k" U1 p3 a

% h- Z3 u9 W: ~& {3 e; A       但是通常会认为贴壁的细胞可能是分化了的或者开始分化的细胞。我还在观望中。