求助关于肿瘤干细胞微球体的传代

cookiezhang

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; }( J3 `8 I8 D2 A7 f% |请教深海寂寞鱼，一般的文献中无血清培养基都用的DMEM/F12，如果细胞本来的培养基是1640或者是DMEM，那还要更换培养基或者直接在原来用的那种培养基中添加细胞因子啊？

深海寂寞鱼

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8 N% N* W1 h4 e' \$ x* ]% u7 j: Qto cookedzhang:
3 v) n' _" [/ s1 [& V5 m$ j( |5 n( o5 j9 \, o
     呵呵，你的这个问题我也想过。后来我还是用DMEM/F12 加的因子。
0 W5 {4 Q# a, y  t# p" ?4 o2 A8 J: m
     原因有两点：
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' c" J# n. U! u     1. 因子实在太贵了。
% x( p/ \) N# f& g        对我来说，不可能每种细胞都用自己的培养基加因子（我是一次配500ml）。
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     2. DMEM/F12相对于DMEM和RPMI1640的成份更多一些。（嘿嘿。。。我也就是自我安慰一下）
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         当然，成份多的未必就是最适合的。
7 g( C4 b9 Q9 i. \7 L3 q
* O$ B* q, }& Z: H# @3 Y$ L         你也可以考虑把因子分装成小份，然后添加到不同的培养基里，制成每种细胞专用的条件培养基。% V% T" V3 ~3 x6 T: A
        

cookiezhang

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1 B* Z3 g+ y, p) A) ?" G. ^6 `1 K谢谢，再问关于B27添加剂的问题，invitrogen公司网站上介绍的这个是神经干细胞培养基添加剂，可是有些不是神经肿瘤细胞的无血清悬浮培养也加了，当然还有一些没加，好像都能成球。这个加和不加有什么大差别吗？

深海寂寞鱼

呵呵......这也确实是个问题。我曾经也为此苦恼过。
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" x1 Z; b# \8 |3 V7 i  e我的理解是，由于我们的无血清培养条件一定程度上是来源于人们对神经干细胞的认识，
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所以实体瘤研究时也沿用了这些已有的知识体系。所以会以DMEM/F12 ＋ B27 ＋ bFGF ＋ EGF 为基本的培养条件。
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我没有尝试不加B27。但是可以推断的是，不加B27细胞的生长条件可能会比加B27的差一些。
" M. H& F9 ?& b* Q# z+ g! Q( n* t$ J5 O! k1 ~3 R/ g7 S( l
你可以看看B27的主要成份，估计能对你有所帮助。5 I0 n5 G0 U6 a1 t3 p" w- J
: J9 ~% m: r1 }9 M9 {1 c) f
论坛里的链接：http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... 2B%B3%C9%B7%D6.html

深海寂寞鱼

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* B5 S$ d$ w+ ^& \1 s5 m* X呵呵......这也确实是个问题。我曾经也为此苦恼过。
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我的理解是，由于我们的无血清培养条件一定程度上是来源于人们对神经干细胞的认识，4 P: ~! L! A. R! ~

1 `, ?: A6 v7 `所以实体瘤研究时也沿用了这些已有的知识体系。所以会以DMEM/F12 ＋ B27 ＋ bFGF ＋ EGF 为基本的培养条件。
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: `. L( z4 @$ ~$ V+ i+ K6 Q我没有尝试不加B27。但是可以推断的是，不加B27细胞的生长条件可能会比加B27的差一些。% X4 k8 T& c. ^3 R0 j
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你可以看看B27的主要成份，估计能对你有所帮助。% B4 Q4 a9 j# `, B  X0 x

2 c7 C" I& I9 s6 y5 K论坛里的链接：http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... 2B%B3%C9%B7%D6.html
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cookiezhang

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* _$ f/ T! }/ M0 F. x0 ~' i2 Z深海寂寞鱼，想请教一下问题，你用来稀释细胞因子的BSA是哪种的啊，我在网上查，怎么那么多种啊，头大的 很呢。帮忙啊，急。

深海寂寞鱼

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9 {0 W: l3 ?( b/ x& m, x! Y8 x7 M0 n5 L) @+ v2 {4 J3 c1 j* x
to cookiezhang兄：7 Y. r( f! g9 e6 ^( B8 X% b4 e  M$ f
& I$ ?  i. A$ b" B
    我稀释细胞因子时没有使用BSA，我是用培养基直接稀释的。1 n8 r+ T8 G1 I6 ~

$ x; n, A- _2 g( x) j    具体方法见以前的帖子：
$ P/ |4 ?2 E$ G0 C* e
- G  `. I) {7 @    http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... ight-peprotech.html
* C! \7 r* O  C! F  N) q& Z* n4 `. \& K; u- Q; |
    希望对你有所帮助。0 w! A: W& o  E  Z2 E

; o# M8 k- N" L5 L    有问题欢迎继续交流。

cookiezhang

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; Y. E! ]# E+ s$ x2 W; T/ |0 Z7 b' v3 ?, |' @1 I
请问悬浮生长肿瘤球要怎么换液啊，培养三天了差不多可以换液了吧？是半定量换液呢还是低速离心后重悬呢？半定量要先静置多久啊，怎样避免损失细胞啊？低速离心的话要什么样的转速多久啊？低速离心后再吹打的时候是球还是单细胞了啊？问题比较笨，经验丰富的前辈指点一下吧！谢谢！！！！

深海寂寞鱼

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+ Q- z) X4 ?, {4 ?$ o+ ?% F8 `+ b8 |& @& M$ E1 h. p
to cookiezhang 兄：
. M& c5 m0 f; }& K4 |  A' T( v' c$ S% T+ F4 }
     看来你的实验在不断的进步啊，恭喜恭喜。- Z) {) B1 {  v3 x

9 u! u9 v8 A* t( w     有关肿瘤球的换液方法，主要看你的目的。
6 r- |- p5 {. l, w' s( u- I
% V3 \! v3 E( C% B3 y: v& p* @     1. 如果是已经养的非常漂亮的肿瘤球，那么换液可以不用那么频繁。
! W5 @3 D( r, R3 _/ |) q! K) C: [  u5 h2 {) v( u) [+ r. x* g
如果你担心生长因子消耗影响细胞生长状态，那么可以考虑每三天加入适量的生长因子，使其终浓度符合之前培养基的要求。  B' b/ h' L4 q( F

# \- P' x. _- `6 v2 O我一般是每3－4天直接加入半量含有生长因子的培养基，10天到14天左右传代（根据实验需要的细胞量和时间，控制接种的细胞浓度，间接控制传代的周期）。9 H5 B8 F; ?% C  }" N; d

3 {% r5 ?$ i. \% ?$ S5 Q( j     2. 如果你是最初几代的原代组织肿瘤球培养物，由于可能会混入其他细胞成分，比如悬浮的红细胞，贴壁的纤维细胞，那么你可以根据细胞的状态，考虑在3天或者一周的时候，把培养物吸出来，低速离心（800rmp/min）3-5分钟，弃上清后加入新鲜培养基，用手指轻弹离心管底部重悬细胞，重新接种即可。
% m$ U# l, o5 u$ ?7 o9 d! d* v' m- _' ^6 P! C
          至于你问的静置法半量换液，也是个不错的办法，只是相对会多损失一些细胞。通常静置5分钟就可以（如果你的肿瘤球还很小，那么你可以静置10分钟，这样虽然你可以多回收细胞，但是同样也会给杂细胞提供更多的沉降时间）。静置结束后轻轻吸取上半部分的培养基，加入等量的新鲜培养基，同样用手指轻弹离心管底部重悬细胞，重新接种。
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        3.其实，细胞换液还是需要你根据自己经验调整的。注意观察你细胞的生长状态和培养基的颜色，才是一个相对客观的东西。平时大家所说的换液时间，会受到你接种的细胞密度、培养基的多少，细胞增殖快慢等等因素的影响，因此仅仅可以作为你换液时间的一个参考点，你需要根据自己的经验，在这个时间附近调整，切不可生搬硬套。
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( B( c4 |" s/ r  @        祝实验顺利，天天开心！( F- p, j; v' Z3 h) h; g2 T2 ?

龙之吻

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- B5 B+ J5 Z# r) L
深海老师你好，我想请问您下，传过好多代的肺癌细胞还能做干细胞球培养嘛？另外，用咱们最普通的国产六孔板是不是能起到超低粘附板的作用？有人说胰酶-EDTA消化对细胞膜表面有损伤是吗，据您经验应该可以用吧？