养过MEF的帮小弟看看自己怎么长成这个怂样了

yyp0609

第一次养，用的细胞是04年冻存的，拿出来养了3个150mm dish. 冻存了15管，每次拿出一个养做转染实验。但是细胞复苏后长的样子怪怪的， 基本都是大大的圆的，有时候也会出现正常点的，刚开始以为细胞复苏后密度低了，可是密度大了还这样，请教下高手是怎么回事。培养基用的是高糖含丙酮酸钠的DMEM(500ml)+10%FBS+1%NEAA+1%P/S+0.75克NaHCO3

yyp0609

谢谢了， 有可能是细胞时间长了  我想办法看自己能否做一点细胞。还有L-谷氨酸对MEF的影响大吗？ 好像有的说要加，我在实验室没找着。

yyp0609

谢谢楼上的兄弟们，新年快乐。我细胞复苏完就这样了，因为要用尼古丁孵育10-15天，所以起始密度不能高了，第二可能是因为细胞是04年的，不知道以前穿过几代，可能太老了，第三可能我复苏的时候可能加培养基有点快了，我想主要可能是有这几点原因。我会先把操作在精细一点，看看情况，实在不行只能重新做一批细胞了。

yyp0609

  v/ i- K  W3 H  o1 w% G

/ W  M$ G0 g- O* h' I谢谢， 结合前几个兄弟的意见，昨天又复苏了一管  只铺到一个10cm的dish，起始密度大概40%。以前同样的细胞我铺到7个60mm的dish里，起始密度10%都不到。 情况好了很多，虽然也能看见有分化的和老的，但是比以前好多了。看来MEF对初始的细胞密度要求还是很高的。下一个需要解决的问题是怎么在试验的15天以内少传代，免得都分化了。现在还在迷惑中，不知道谁有好的建议