养过MEF的帮小弟看看自己怎么长成这个怂样了

yyp0609

第一次养，用的细胞是04年冻存的，拿出来养了3个150mm dish. 冻存了15管，每次拿出一个养做转染实验。但是细胞复苏后长的样子怪怪的， 基本都是大大的圆的，有时候也会出现正常点的，刚开始以为细胞复苏后密度低了，可是密度大了还这样，请教下高手是怎么回事。培养基用的是高糖含丙酮酸钠的DMEM(500ml)+10%FBS+1%NEAA+1%P/S+0.75克NaHCO3

懵懂干细胞

学习中………………

zlx0814

我的细胞有时也有这样的形态，请教专家后告知细胞在冻存或复苏或培养中受到比较严重的伤害，生长状态不佳，尤其是你最后给出的2张图片，就是细胞生长状态不好，我们不用这样的细胞做转染，如果有你说的正常点的，可以转染试试，再有解冻这样冻存时间长的细胞时要注意些。

yyp0609

谢谢了， 有可能是细胞时间长了  我想办法看自己能否做一点细胞。还有L-谷氨酸对MEF的影响大吗？ 好像有的说要加，我在实验室没找着。

lemma710

看着像长过了的细胞呢，是不是传代比较多了呀~或者是你提取的MEF细胞不够纯呢~

周会

很明显是分化了，还有你的那个密度真是太低了

show0ji3

细胞好老呀

周会

另外就是你要不加点谷氨酰胺试试，最好用四代以内的细胞啊，要是传代次数太多了就基本不能用了

yyp0609

谢谢楼上的兄弟们，新年快乐。我细胞复苏完就这样了，因为要用尼古丁孵育10-15天，所以起始密度不能高了，第二可能是因为细胞是04年的，不知道以前穿过几代，可能太老了，第三可能我复苏的时候可能加培养基有点快了，我想主要可能是有这几点原因。我会先把操作在精细一点，看看情况，实在不行只能重新做一批细胞了。

zsc78

个人觉得是细胞冻存太久的原因,有大量死细胞,同时由于你接种密度比较低,细胞在复苏后老化比较严重;建议细胞复苏时的密度高一些,传一到两代,观察细胞状态怎么样,再开始做实验。也许这样细胞的损伤能够有些恢复。祝好运！