pri-miRNA的超表达能用pEGFP-C1吗？

runsong

4 X) N6 m$ S9 Z- \8 K* e4 r8 I" }0 I
本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。. V9 O; r. r, R! u. e: d
但有几个问题想求教各位前辈
  E) u3 k1 P. l- z" [1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。
; a" \  E7 H! G& t! l  @2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。
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runsong

本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。' y( ^) b8 ?, F$ q1 @
但有几个问题想求教各位前辈
7 Q3 U+ z( ~9 d- T1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。
3 J7 s7 W: {" S/ E2 _2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。
* @. p: Z. l; R/ C' J' J) V

深海寂寞鱼

to runsong战友：
, d. b6 T$ ~  U, V$ Q
2 a& i; S3 w+ H# Q; O, h9 [% m: K   你的这个设想是完全可以实现的。我们实验室就是这么做的。3 n/ G3 u" m" B" \

- e/ }2 V; p7 a2 S   有两点需要注意：! |+ d' N( ~4 ^2 ~  m. [
1 G  F* R8 R) e6 @/ R" s- M
   1. 因为pEGFP-C1载体最初是设计用来做C端融合表达的，EGFP的末端没有没有终止密码子，它的终止密码子在多克隆位点的3`端。% t, l) V' u$ l; ?
   
  L! n! x. H( B6 q2 y2 G- ]/ H       因此如果你想把你的pri-miRNA插入到多克隆位点之中，就要注意在pri-miRNA的5`端加上终止密码子。( }6 O% z# P3 j2 ~$ @; P$ \
  X6 _, I2 V8 {! i2 J# q, v
       我是用BsrG I和另一个限制性内切酶将pEGFP-C1切开，然后插入pri-miRNA。
0 [: T8 n/ Q& a$ e, Y( A, N
4 W+ p! T! }3 K5 m       由于BsrG I切开时，会切掉EGFP的几个碱基，所以会在pri-miRNA的5`端补上这几个碱基，并且加上终止密码子。
9 d1 }. {* y. W# N, f* Q. D. ^1 C$ a) m
  s3 g: s0 s, ^! S0 m7 F& U% n% i       这样做的最大的好处就是不会使EGFP多任何一个碱基。0 S6 _& L* y& @: i& b+ x
9 H$ T2 _4 W* F
    2. 在克隆pri-miRNA时注意克隆的长度，以防pri-miRNA不能被加工成熟。
) s3 z& T5 A2 Z  _8 q- e7 ~
' \/ S( C) Y' j- Z4 s1 g2 |大胆的做吧。这个不会太难的。 如果有问题可以继续交流。

runsong

跪谢大神指点

siyue13

寂寞鱼解释得好详细，膜拜一下

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子1 O. f! s/ Z" F" a0 {: t

2 F0 x5 v# W6 s2 j' f- m1 \非常感谢您的指导，但我还有三个问题想再向您请教、确认：
3 t" n! @7 w7 ^1 p3 I+ [1、若不在pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA也是会正常表达的，但GFP后会融合一个由pri-miRNA编码的小蛋白，有可能产生不可预知的结果，干扰试验。
$ x. L( l7 l( K; ?2、GFP是由未被卷入pre-RNA加工过程的mRNA翻译而来的。其数量要少于pEGFP-C1空载体的GFP表达量。( M7 {) u8 G  A  t! J
3、pri-miRNA克隆的长度有何硬性规定，前后各延伸100可以吗？" c# O4 E( s3 ^* T$ Y
4、能否给我几篇您已发表的文章供在下学习借鉴。# {! v7 U6 d* e8 i
最后祝您好人好运好心情！

深海寂寞鱼

1 y5 y  I' U' e7 e6 n, Y- A" X$ m! N0 Z3 I* }- e
回复 runsong 的帖子
" k7 `) B$ f/ f' K: i# w2 ]% S2 w8 W0 c* e. f( n3 T3 {- H8 k8 [
to runsong兄：
9 t+ k4 ]3 t$ P4 k, g
6 I9 D8 j8 M& a  k- q2 L7 m    指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。
) n8 _4 E  K) P+ A
- `4 K8 K; C- ]( b" V    对你的问题回答如下：2 w, i# a% p8 X1 Z* P) T0 U1 ?

& M; u" H) U7 o+ S) U    1.  若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。4 M* ?' @9 }( Y, `  ~1 m7 u

6 U* Q9 h  f5 ]) Z& c3 i0 ]         当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。
" O! [6 L" m7 R. }( b1 C3 z5 g" s
# Q% U. Q4 \  ~: ]       而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。7 j) f% c1 ^) }9 O3 ~* B5 r

; A" d) {0 y% T2 ?  x9 p# |        所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。
, T6 @9 a1 ~# a) A, f* B' Z
3 A# i" ]$ N! c0 f      2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。
% A+ C; k- X3 |- I8 J* K3 s
" \( S$ ]0 k- R) J* b  x3 u. s: @          因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。
4 x# c5 E! T1 P  {; j2 o' N% j   
/ f6 D, `, r+ M* q4 j1 P& Q# N          GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.
0 U- L$ H% W4 n# w   
' ?  o$ J+ j2 b3 E, D       3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。8 I1 G9 c: a. P+ r7 O* d( ^5 n
        
1 x2 O- r/ n6 x            不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。
! G' q8 f5 u* I' m" w; \6 I& v4 ~. D- z  P, p: e: r
            或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？  $ V/ |+ {+ _( B! T8 a" N# H2 A. w

# [$ ~# G$ `1 ?# q' d$ t! K
% i# n: Z' s, u6 H5 B( p         4. 我目前没有这方面已经发表的文章。
# r# ^1 W) V9 I  9 W( ~5 S) d5 `; O& V
             但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。# d! x4 A+ p7 B' x5 p
+ P8 v3 C/ }" r6 \: T, x* I
/ v# f7 m( O9 |+ R5 r! @
            最后，也祝你实验顺利，天天开心。( j' A8 b; O/ E/ q; y4 i5 D

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子& s+ F3 c# P" G! l

& W8 R" D( u) W' h- U  o1 O' b, h我画的这幅图有错误吗' A7 C. _& [0 J8 M) }7 L

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子7 n- J; g. D' R5 I
: R  o6 L/ K2 g/ E8 G
呵呵 ， runsong兄，你绝对是个天才。
2 d/ q  m8 h; V; ?+ G7 y% c# f9 `. x% U6 q
我也很喜欢画图来说明问题
7 D5 A$ P( B! e$ H7 ~: j) n& `- i+ H) X# ^+ I
不过跟你一比，我差的就太远了。
5 B: _) r# A, t4 q, \( }+ H4 @0 l, {; s4 l) _  ~
你的图怎么画，教教我啊。
, Z6 Q0 F' X' K0 S' ]: ?$ `1 o7 U( l1 j, L. V) O8 i: P' a
貌似你要做miRNA-34 ?   呵呵。。。。。好像文章不少啊。还有个miRNA-21在肿瘤方向的文章也不少。

runsong

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. W# `. k9 U5 K7 V9 j; }# p# q& \3 ~
载体图是用clone maneger画的  其他一切操作用的都是PPT或PS  
( ^8 {7 T) t/ J. |) w我是土八路，信手涂鸦