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本帖最后由 深海寂寞鱼 于 2011-1-13 18:04 编辑 4 F. | b# P x$ y+ l% F9 V! Z' A7 \
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回复 runsong 的帖子5 _4 k4 _* r& a$ K" v
& G3 D* j2 }5 y* q" O
to runsong兄：
9 v4 {/ ], S5 h1 I6 R& H1 e% A. Z% j4 j ?
指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。
4 h. G" Z5 @3 n4 U% w. K5 }: Q; R! I
对你的问题回答如下：
+ F6 G! T" d" n; g9 J# x$ a) P9 R: p% m+ ~6 r8 z
1. 若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。
$ K5 Z$ G+ O* o, ^. b; ?/ b: \, W- K/ V
当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。6 T J! q) z/ Z; e) U) r2 E' g
' B/ O& O6 Q6 n/ U5 P9 N% z
而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。
+ X/ m8 c o0 o
0 z8 {: O9 i. t! @ 所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。
; t* B; q) d, U1 f- ?8 G; P: M/ I5 r) [# d
2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。
+ s* K+ `& {. t/ l8 f; t. { C' P+ V5 r; u X
因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。
8 Z; B( A4 Y, y+ l7 g" y" v ; _! z( _( a: F" [% ?
GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.! z: Z( n- i& q5 X# C
: Y( \# `7 F3 }4 o8 j
3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。1 W; _% I7 ?: f' u
) t5 {8 E( \) h5 Y- k
不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。
& ~8 W, C; O- E
5 X0 ~, l, X: Y( @7 C 或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？
$ v4 P5 O7 p9 j6 x5 {7 b3 a& P) N4 x7 }* o: G$ c" c4 ?% Q
: L5 ~2 |9 n2 n3 ~0 C
4. 我目前没有这方面已经发表的文章。
; \" Y$ Y% A0 B3 O ) t0 O# F' v4 R, D; ]/ e/ i0 L
但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。& N* K3 U3 X/ b1 S! d' N
% m3 {( | h& a; E( ?5 L3 {# R- F; Y8 a
最后，也祝你实验顺利，天天开心。
- O q( m8 z, l/ W. T9 Y0 ^ |
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发表于 2011-1-2 17:25
