pri-miRNA的超表达能用pEGFP-C1吗？

runsong

) Y' X& B9 z  Q. K( v! \) s( q

" P7 |; Q7 C3 f6 u" C本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。
9 n9 j2 y- w1 G/ ?但有几个问题想求教各位前辈
5 r$ f2 v! H% c3 |1 m5 [5 C6 O1 U1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。# v5 F, w# z/ H. b
2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。, J- {2 e7 t9 z9 k6 A0 G

runsong

本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。
# \5 O& h0 ?5 ~$ t' I; H+ t4 T$ j  V但有几个问题想求教各位前辈: X5 L2 U  `+ Y. H/ A9 J: C2 a
1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。6 f; Y( s# f* @9 ^. @
2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。
0 M/ h" s  s" p; c. |3 b2 E8 Q5 W/ z

深海寂寞鱼

to runsong战友：
0 W. G# n: {6 A# L
# K$ S7 S, G. V( |; f) d$ f   你的这个设想是完全可以实现的。我们实验室就是这么做的。
( x0 S, Y6 S5 ?' y( |' t8 l8 A, Y5 N5 [6 A6 F
   有两点需要注意：/ C- _( b2 n) Q9 n3 {$ Q

% c& `- w! [; g  w7 G# i   1. 因为pEGFP-C1载体最初是设计用来做C端融合表达的，EGFP的末端没有没有终止密码子，它的终止密码子在多克隆位点的3`端。
8 d5 G! ~9 s- N/ Y, W: G   
/ q) {3 y& N. ~( `       因此如果你想把你的pri-miRNA插入到多克隆位点之中，就要注意在pri-miRNA的5`端加上终止密码子。
, b% G2 }9 i4 v6 m  i
) }0 F; q% S7 C+ k" u       我是用BsrG I和另一个限制性内切酶将pEGFP-C1切开，然后插入pri-miRNA。
" q* X; M" ?) k# ]& n9 c
( i4 O4 D) k6 \2 W$ y/ V" R. X, \. B       由于BsrG I切开时，会切掉EGFP的几个碱基，所以会在pri-miRNA的5`端补上这几个碱基，并且加上终止密码子。8 S" Z1 O, p! x5 b
% s0 j1 c* b: G# n0 k! X
       这样做的最大的好处就是不会使EGFP多任何一个碱基。
! s" ?9 g$ F2 K) F, `- v$ G, h2 p0 r" v3 z4 g. A6 u
    2. 在克隆pri-miRNA时注意克隆的长度，以防pri-miRNA不能被加工成熟。
* H3 {/ @. [. O0 L9 g1 r% U6 t) e: h6 W+ j, u
大胆的做吧。这个不会太难的。 如果有问题可以继续交流。

runsong

跪谢大神指点

siyue13

寂寞鱼解释得好详细，膜拜一下

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子( v& F; r# S; S* T' H% m& \% V+ G+ K

/ n  H8 a1 i* }* L" j非常感谢您的指导，但我还有三个问题想再向您请教、确认：
' N( C( B2 G: M  T7 [6 @# X1、若不在pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA也是会正常表达的，但GFP后会融合一个由pri-miRNA编码的小蛋白，有可能产生不可预知的结果，干扰试验。; W1 }' F/ F3 ]! g. h$ z" ~4 ]
2、GFP是由未被卷入pre-RNA加工过程的mRNA翻译而来的。其数量要少于pEGFP-C1空载体的GFP表达量。0 Q0 F  o5 I! t
3、pri-miRNA克隆的长度有何硬性规定，前后各延伸100可以吗？
. S. W& F2 G. {) ]" ~! U4 z4、能否给我几篇您已发表的文章供在下学习借鉴。
- j) [! R8 R. i: m/ E/ r最后祝您好人好运好心情！

深海寂寞鱼

% A) e. |9 W: @) b" s
, m( S! S! a1 J8 [: H6 ~) s回复 runsong 的帖子
# v6 K" H2 p; v2 s7 ]/ D
' m4 l2 e7 Z0 w& f5 m. [to runsong兄：
1 b% h9 N/ |- g/ C- F; i: P" Y& }4 i. M: V+ m9 R7 ~3 v+ O& |
    指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。
) w2 G3 c+ H! Y+ u  Z
0 t5 K3 O1 L, x' a    对你的问题回答如下：
$ |7 M9 Q4 F# Y# r- C4 O+ M& U7 g6 M1 }% i2 d% \
    1.  若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。; U) v  I5 p, k& \$ A5 C) _% t

0 M. `5 y7 j2 b( s$ [         当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。% ]% ^, F4 n0 b/ c, ~8 L8 k
) _( f1 A. {% f+ ^
       而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。8 ^9 s9 m: p; a/ ^. s5 e
& v$ u5 T; H* C: b% Y$ D
        所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。
* H% L* E3 I6 {5 E! J7 b1 a& W$ }2 {8 t1 h
      2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。! [' s) J. D- D
- d. `- l- \7 i, R0 }2 D1 R
          因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。
) b" {, z" x' r: Y. C    ! z& O0 N0 \- ?6 N1 {$ n
          GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.! O  X0 c3 D( R1 J3 I3 R' `5 C
   
& Q3 `, J" C2 m& G( F4 I       3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。
2 U3 a6 b- K, g5 w  I8 u3 ~3 V+ N8 J, ?        
4 D% j& |0 f' X# v) Q            不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。" d" K7 [9 I+ ]1 h3 T2 I

* D: ^9 {+ H5 N# {            或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？  $ M+ Z5 S: ]7 q' |# }3 n3 P

2 P8 D4 X2 ^6 O; K7 b7 O' f
: f4 C0 F0 \3 V$ i: ], f         4. 我目前没有这方面已经发表的文章。% }5 z# d+ C" u8 o
  
! \% Q7 L2 r7 K: Q: `1 \2 w             但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。- _+ k0 ^  l' z: k% I5 X
% Y$ x6 P, i* k* {8 X5 N/ r
* @: p: M4 f3 G
            最后，也祝你实验顺利，天天开心。5 Z. f' {0 @2 D' b" \* H  J

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子+ C# ?; t9 t! ]: g+ N5 }/ i

: {5 H; k+ {- {( l我画的这幅图有错误吗
: T4 `; A0 _9 z) \" f

深海寂寞鱼

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7 @1 S" n" H/ Q! j1 ~% `! u5 J+ p: M# J* }' w
呵呵 ， runsong兄，你绝对是个天才。6 H* i$ w5 {3 l1 j5 H. Y3 v" L" ~+ j
$ r/ S  p0 Y0 d3 _8 G" L% }1 F3 [
我也很喜欢画图来说明问题7 v- ^2 \) x$ m# O* F5 N
; K6 \3 b5 M1 d% C& e  g
不过跟你一比，我差的就太远了。: E. r( o% x+ ]* [* a
) g/ v) z( O% w
你的图怎么画，教教我啊。  h- o3 D: P+ D, L& q. N
; Q8 A4 J* T! h; U' O3 n
貌似你要做miRNA-34 ?   呵呵。。。。。好像文章不少啊。还有个miRNA-21在肿瘤方向的文章也不少。

runsong

回复 深海寂寞鱼 的帖子/ k6 _! N: A8 y* Q  @  Z

. P5 v0 i7 ]7 l) O载体图是用clone maneger画的  其他一切操作用的都是PPT或PS  1 J* s# j9 h" o9 V; M$ F
我是土八路，信手涂鸦