pri-miRNA的超表达能用pEGFP-C1吗？

runsong

+ ~) ^; `  M- S9 j7 }) F  \# X0 r

; k& G, C8 x+ F9 r$ b/ w本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。+ R) }4 o8 e# j1 c- L3 s' K3 v
但有几个问题想求教各位前辈
, h7 h. r1 J7 P: j- ?6 x) I1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。& O+ A/ H8 }8 B
2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。; l5 a* H7 h0 [

runsong

本人想做miRNA的超表达，而且想在表达miRNA的细胞中共表达egfp等标记基因，原理如图所示。
4 y4 M' T% x2 e但有几个问题想求教各位前辈
8 N, }. s, v& x- K" X: n1、由于pri-miRNA与编码egfp的mRNA是相连的，我不知道pri-miRNA在加工为pre-miRNA的过程中，对egfp的表达有无影响。4 j% P$ ~7 L4 @
2、如果有（我想会有），能否留下能够表达egfp的mRNA。miRNA与egfp的表达能否兼容。/ H; l; P6 ^( a# h7 }

深海寂寞鱼

to runsong战友：
( g  p9 f; b' o; Z; X1 i4 @' {" J' T, X+ U
   你的这个设想是完全可以实现的。我们实验室就是这么做的。6 {6 X, G" L" W

0 R( j8 e  {; d  _1 t   有两点需要注意：, C5 }6 d; Q/ M. l4 @
7 H: L' v- o/ u, a" @+ H
   1. 因为pEGFP-C1载体最初是设计用来做C端融合表达的，EGFP的末端没有没有终止密码子，它的终止密码子在多克隆位点的3`端。
/ E& _% i. V* Y: B# Q$ V    7 j9 {) y7 f& E" y' a" s/ f
       因此如果你想把你的pri-miRNA插入到多克隆位点之中，就要注意在pri-miRNA的5`端加上终止密码子。
" z6 ]7 [: Q7 ~1 ?
/ H+ R) ~+ w  m+ j; {0 I2 }+ U) H2 A       我是用BsrG I和另一个限制性内切酶将pEGFP-C1切开，然后插入pri-miRNA。+ D5 A9 N' _$ E& F9 V
/ B' V# L! i4 y% G" ?
       由于BsrG I切开时，会切掉EGFP的几个碱基，所以会在pri-miRNA的5`端补上这几个碱基，并且加上终止密码子。5 X5 {  R% V0 k; C' R

" {5 Z! c9 z; s! {0 r; L       这样做的最大的好处就是不会使EGFP多任何一个碱基。: o7 p0 q; @( s9 i

% L: p0 N3 A0 t+ ~! N3 W1 p0 z$ z    2. 在克隆pri-miRNA时注意克隆的长度，以防pri-miRNA不能被加工成熟。/ P" z, q! s$ H" e3 K( U9 T
  X5 c/ Z9 F8 h* Q; u" U) s
大胆的做吧。这个不会太难的。 如果有问题可以继续交流。

runsong

跪谢大神指点

siyue13

寂寞鱼解释得好详细，膜拜一下

runsong

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6 G7 d" ]* E( s$ e) x7 s4 p) c
9 m& z7 e( D3 M, K/ |非常感谢您的指导，但我还有三个问题想再向您请教、确认：
1 u% q' [0 P- z6 b9 L! P/ e/ M1、若不在pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA也是会正常表达的，但GFP后会融合一个由pri-miRNA编码的小蛋白，有可能产生不可预知的结果，干扰试验。
. z6 f8 u0 N& s% ~$ Z  y, I2、GFP是由未被卷入pre-RNA加工过程的mRNA翻译而来的。其数量要少于pEGFP-C1空载体的GFP表达量。: V& C9 W2 o8 ^7 a
3、pri-miRNA克隆的长度有何硬性规定，前后各延伸100可以吗？
$ O/ k6 w! b- A! A1 I: E4、能否给我几篇您已发表的文章供在下学习借鉴。
" ^% a' z3 P; f1 s最后祝您好人好运好心情！

深海寂寞鱼

$ H% S9 R0 z8 P6 D5 ~' ]8 X; ~5 E. U+ M# ^9 M% [* Z
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: {* z1 p1 k' o! @+ E. j& }2 [1 _6 T+ }9 G$ }% k( x  j
to runsong兄：
! V4 k: T" i6 D1 X! X3 n2 _: o$ r5 D4 U' v) I6 U+ @8 `* C
    指导压根谈不上，论坛就是让大家交流学习的，你太客气了。
& X# `6 ~3 w( M- q8 p4 r
8 j( m- l+ F( N7 T    对你的问题回答如下：
) G3 s& Y- C9 A5 r  w& A2 V) _  t8 x8 m
    1.  若不在Pri-miRNA前加终止密码子，GFP与miRNA确实都能被转录，miRNA也应该能成熟；但是GFP能不能被翻译成正确的蛋白，那就不一定了。因为翻译的过程必须要有终止密码子才能完成。你想想，pri-miRNA从mRNA链上剪切掉以后，GFP的mRNA或许就没有终止密码子了。因为载体上能提供的那个终止密码子在多克隆位点的3`端，在你的miRNA后面。
% v" d4 P" |0 y( u+ t* O, m2 V( u7 l2 ~! a
         当然如果你不想让你的载体在表达miRNA的同时也表达GFP的话，你说的方法也可以。' u3 L6 b0 _* _+ i

5 \6 b* J1 }, H0 y       而且就你说的，如果不加终止密码子，还可能会产生融合蛋白（由GFP和pri-miRNA编码的小蛋白融合）。0 L4 c3 {; W) M8 h: ~* m
0 Q- Y6 B2 t2 I: a6 U: t" B- w
        所以，你为什么不考虑直接加上终止密码子呢？希望我讲明白了。
3 Y/ x* D( \9 f. W# J2 j
, n1 |. i2 @8 C6 v% E: l      2. 如果加入终止密码子的话，GFP和miRNA的表达比例可能不会低于1:1。
( I: X) m! W3 w9 o) n" j5 K8 F  L* ]# T8 |& [
          因为1条mRNA链未必只翻译成一条多肽链，有时mRNA可能多次翻译。（比如人泌乳时酪蛋白的翻译）。9 Q* v5 L+ l9 k2 a: a- ?% D5 j
   
  \( K& c" i4 G( q! S9 S          GFP mRNA链会被翻译几次不好说。但是与miRNA比的话，至少也是1:1.' ~( n. p% _7 Y7 I3 R
    & e" Z( t# z0 I' j- k$ r. u
       3. pri-miRNA克隆长度有没有硬性规定，我还没有看到文献。一般来说前后各延伸100nt应该是可以的。. v0 B, B4 ~  W
        
1 y" \# c: G0 O) \# |  B. ~. Q            不过你最好看看你具体要研究的miRNA的文献，看看他们构建时前后各取了多长。1 z; n. q6 e, c, `) o
: }% Y* Z! i. O  K
            或者看看你的miRNA是位于基因的什么位置？它是独立的基因表达？或者是某个基因的内含子？  . R6 `# s. U- q9 m% {% M+ j

  W1 V' D3 `* M$ g) C0 {; r/ R3 b, r5 r  }9 i: R* X6 w
         4. 我目前没有这方面已经发表的文章。
3 }0 D/ U& N3 a0 @6 |  ' x/ U& b( \+ L# Z" x, l5 h
             但是我们构建的miRNA表达载体，在转染细胞后，real-time PCR都能检测到成熟miRNA的表达。. ?" J5 Y1 W! o

  o0 m$ K* S" k: z7 l- ]  K# [1 A  \- G& J6 `4 \/ h
            最后，也祝你实验顺利，天天开心。
, A& y7 H2 j2 f. a

runsong

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' K/ I' ~$ m- P; e# P7 x9 X2 i- J$ T9 G+ R( Y. R4 s" h) s" x+ T
我画的这幅图有错误吗
; p0 f$ A5 y8 c8 e3 _

深海寂寞鱼

回复 runsong 的帖子3 R  O4 m& S5 {" p8 e

: K: U; @8 c) E2 _$ w呵呵 ， runsong兄，你绝对是个天才。' Q0 N0 p% P4 i' i& {7 a3 ~
7 y6 y+ F/ S  _3 Z8 P, J6 j. F
我也很喜欢画图来说明问题( S( R/ j( Y, ^$ c
. |5 C! [6 k3 S: k
不过跟你一比，我差的就太远了。) K9 I- \0 t* g

( [0 N) }$ a: q" W2 J# w( f你的图怎么画，教教我啊。3 F+ U, w. w; h7 @: N

1 y, m; _+ s. E* r* E4 V貌似你要做miRNA-34 ?   呵呵。。。。。好像文章不少啊。还有个miRNA-21在肿瘤方向的文章也不少。

runsong

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9 Y& A* x' x8 j5 k( Z- p  X" N- ~0 y$ J0 X
载体图是用clone maneger画的  其他一切操作用的都是PPT或PS  6 T  h# l" ~, n
我是土八路，信手涂鸦