密度梯度离心

新手

本人做外周血内皮祖细胞的分离，培养。抽取人外周血10ml，PBS等倍稀释，以1:1（或者2：1）叠加到人淋巴细胞分离液上，以2000转/分，20min离心，brake：6，温度：18度（离心机为HERMLE低温高速离心机），离心后只有3层，没有白膜层，请教各位那个地方出了差错呀？

Cherry

brake：6  是什么意思啊

Cherry

速度要快升慢降，是不是降速太快！
5 U- @" e, b' e# J. _9 B- Z* B

deron

步骤基本正确，你仔细观察一下第一层是否浑浊，如果呈现含细胞样的浑浊的话，把离心转速调到2500r/min——另外，不排除个别的血样本身就不含白细胞的可能性。

jinyiran

brake是不是有点大了？一般做这个实验的时候要尽量将brake设置的小一些，通常就设1或者2比较好.

新手

离心机是角式离心机，离心完后，最底层的红细胞都是偏向一边，这是不是和离心机有关呢？
- i$ _: J6 j% A. E稀释的血液叠加到人淋巴细胞分离液上后，半分钟红细胞就会自动往下沉降，离心之前界面就有些浑浊了，这会不会影响到离心后的分层？
* V* S" p% ]7 n3 B) H离心机上的brake是实验室老师建议这样调的，具体该调为多少呢？理由是什么呀？7 u! q  U0 t5 C
多谢！！！！！！！

parcuezhang

1、外周血1：1用PBS稀释，不加淋巴细胞分离液，以2000转/分，30min离心，去除血清（大约占一半）。
( W1 H( N/ P( r/ X7 {! G) h2、剩下液体：以1:1叠加到人淋巴细胞分离液上，以1500转/分，加减速为0，30min离心。( \5 o- F- H7 [3 n( D! K
就可以见到白膜了。

andreqin

建议将PBS换成细胞培养基原液，利于观察

meister

建议1：! \) @0 r+ s  S- x
更换Ficoll2 P2 j3 ^% n! {0 C" _) ^
2. 调整转速时间% w  I& z( P% Z& v
3.brake1-3
% _! `7 J) E( \. i4.红细胞加入后出现沉降是正常现象，不必忧虑
0 F0 s$ c* x0 B& x0 G4 |! s5.PBS和血液混合均匀，利于单个核细胞释放
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