密度梯度离心

新手

本人做外周血内皮祖细胞的分离，培养。抽取人外周血10ml，PBS等倍稀释，以1:1（或者2：1）叠加到人淋巴细胞分离液上，以2000转/分，20min离心，brake：6，温度：18度（离心机为HERMLE低温高速离心机），离心后只有3层，没有白膜层，请教各位那个地方出了差错呀？

Cherry

brake：6  是什么意思啊

Cherry

速度要快升慢降，是不是降速太快！+ {: S! l9 }, g- Y. P0 Y$ b

deron

步骤基本正确，你仔细观察一下第一层是否浑浊，如果呈现含细胞样的浑浊的话，把离心转速调到2500r/min——另外，不排除个别的血样本身就不含白细胞的可能性。

jinyiran

brake是不是有点大了？一般做这个实验的时候要尽量将brake设置的小一些，通常就设1或者2比较好.

新手

离心机是角式离心机，离心完后，最底层的红细胞都是偏向一边，这是不是和离心机有关呢？
! v0 G: v. w% i* d稀释的血液叠加到人淋巴细胞分离液上后，半分钟红细胞就会自动往下沉降，离心之前界面就有些浑浊了，这会不会影响到离心后的分层？4 |2 P! L) A, D) d; |: x& k
离心机上的brake是实验室老师建议这样调的，具体该调为多少呢？理由是什么呀？$ Z3 \3 ~5 N3 ~& n! q( t
多谢！！！！！！！

parcuezhang

1、外周血1：1用PBS稀释，不加淋巴细胞分离液，以2000转/分，30min离心，去除血清（大约占一半）。1 ?  x% i. a  B) a, Y
2、剩下液体：以1:1叠加到人淋巴细胞分离液上，以1500转/分，加减速为0，30min离心。
. X" r1 y$ ~  l0 u  p' u就可以见到白膜了。

andreqin

建议将PBS换成细胞培养基原液，利于观察

meister

建议1：) D9 E* t. p# _, x' |6 Q% z1 x
更换Ficoll
( ?( J" S( p2 g; n+ h2. 调整转速时间  C+ d6 h$ L5 v5 \
3.brake1-38 C1 n( y- b( c
4.红细胞加入后出现沉降是正常现象，不必忧虑
. k! P8 y" @4 ~( U5.PBS和血液混合均匀，利于单个核细胞释放
+ l; s! Z# e% z6 a8 ]1 N" s) ], v