利用小分子复合物诱导出ipsc原文及简析

zerollx

    体细胞的重编程可通过 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc or Oct4/Sox2/Nanog/LIN28的病毒转染法而实现，最近又有报道仅用 Oct4/Klf4便将神经祖细胞重编程为ipsc，这是因为NPC可内源性表达OCT4.这篇研究中，我们用小分子BIX-01294 and BayK8644联合病毒转染Oct4/Klf4入小鼠的成纤维细胞，该细胞没有相关的内源性基因的表达，也得到了ipsc，说明通phenotypic screen得到的小分子能够替代病毒转染用的一些因子如OCT4，并且提高了重编程的效率（相比于去掉c-Myc的Oct4/Sox2/Klf4方法）
9 n1 w4 l% B; Z0 |, u; m        BIX 与Bayk 的作用机制：5 P  f4 H+ m. P# G' H4 {
   1、BIX: 在NPC的诱导试验中，进一步的研究表明在此过程中，G9a histone甲基转移酶受到抑制(G9a HMTase)后，重编程的水平大大提高了，BIX便是G9a HMTase的一种抑制剂，
, b1 e8 x* x) L% o* x9 M( _& ^) x3 q4 u4 ?6 @  C6 i: Q: e
    2、Bayk 是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用。L-type calcium channels 在细胞内的不同组织内介导一系列的过程，如blood pressure regulation, smooth-muscle contractility, insulin secretion, cardiac development, 其通过CREB作用使Ca2+释放，改变cAMP水平，此外，Ca2+在mESCDE 增殖过程中也有着重要作用。
2 H- H; H: Y6 J6 a, V: i0 W; {: z$ |       
9 a5 V$ n! g5 _2 n, b        BIX-01294 、BayK8644、Oct4和Klf4共同作用与小鼠的成纤维细胞的结果：+ P7 }9 V# i6 y" X4 p9 V% v9 A" _0 J
        仅用OCT4和Klf4得到的ipsc形态不明显，ALP也很弱，而且无法扩增，
  N0 w. Q) V, P: h) W- c        用OCT4和Klf4加上BIX处理，在此之后的14-21天内，得到强表达ALP的克隆，而且Nanog, Oct4, and SSEA-1也呈阳性，但其诱导率明显低于 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 4因子诱导和OCT4、Klf4、BIX联合诱导 NPC的过程，这个结果表明表观修饰在重编程的过程中也起着重要的作用。% j2 L) F" q7 v$ M
        在OCT4和Klf4加上BIX的基础上，又添加了其它的小分子，结果又发现了5-azacytidine、RG108和BayK，前二者与BIX相似，是 DNA methyltransferase的抑制剂，后者是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用，而且在无BIX处理的过程中，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK是无法引起重编程的。
+ X2 u3 |: U2 Z; T/ T( P       
- Z* |- E, N# `8 O        进一步确定其多能性/ ~  @9 f' b1 P. b6 A& \/ j
        用含Oct4-GFP reporter的MEF为材料，结果与上述相似，即仅用OCT4和Klf4、用OCT4和Klf4加上BIX处理时得到很少的克隆。用OCT4和Klf4加上BIX、BayK处理时得到较多的克隆，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK无克隆形成。+ Q  C# A) D& \, R% @% k/ X' m
        检测其多能性：
5 B  P# L! C$ X: q5 j1、DAPI、APK染色和 RT-PCR显示这些GFP+OK2B iPSCs 表达了典型的多能性标记： ALP, Nanog, Sox2, Oct4,SSEA1, c-Myc, eRas, Esg1, Ecat1, and Fgf4./ d) W0 }2 p% [3 h$ U8 j0 E5 O
2、Bisulphite genomic分析Nanog 启动子的去甲基化程度与ESC相当，与MEF想去甚远。
9 [" _: Y; Z- g3、Transcriptome分析analysis showed that expression profile of OK2B iPSCs is greatly similar to the one of mESCs with a Pearson correlation value of 0.96, while significantly different to MEFs’ profile with a Pearson correlation value of 0.84 as exemplified in the clustering analysis
2 A, I/ {2 i" L0 c* t, E2 L, t4、分化潜能:9 j$ X6 Z& p) H  ~% @- x
      （1） 类胚体实验：对得到的EB用DAPI染色，显示三胚层均有分化：内胚层 (Albumin and Pdx1),中胚层 /心肌(CT3), 外胚层/neurons (bIII-tubulin, Tuj1).
' _0 X( I! `7 {  T  V1 y; M      （2）2N囊胚注射：将ipsc注入8细胞期的囊胚中，再移植入同期的小鼠子宫中得到嵌合体小鼠，将得到的一个雄性嵌合体小鼠与野生型雌鼠杂交，得到的后代小鼠中得到了有LacZ+和Oct4-GFP+细胞的小鼠，说明该ipsc能整合到生殖系产生精子，证明了其全能性。

zerollx

回复 flydayzhu 的帖子+ l9 N, x; Z+ {1 }5 G" b
4 ?5 X$ ^# \) a/ N
呵呵，那篇文章我也想要啊……

zerollx

回复 stonelee2050 的帖子
6 f4 F2 ^% J! _/ Q# [2 z/ P* p- ~( {# a9 R
这个文献里面有，仔细看看就知道了

zerollx

嗯，没注意与最新的那篇文章区别开来，下次一定注意！！！！