利用小分子复合物诱导出ipsc原文及简析

zerollx

    体细胞的重编程可通过 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc or Oct4/Sox2/Nanog/LIN28的病毒转染法而实现，最近又有报道仅用 Oct4/Klf4便将神经祖细胞重编程为ipsc，这是因为NPC可内源性表达OCT4.这篇研究中，我们用小分子BIX-01294 and BayK8644联合病毒转染Oct4/Klf4入小鼠的成纤维细胞，该细胞没有相关的内源性基因的表达，也得到了ipsc，说明通phenotypic screen得到的小分子能够替代病毒转染用的一些因子如OCT4，并且提高了重编程的效率（相比于去掉c-Myc的Oct4/Sox2/Klf4方法）: [0 Z" D# M) f& L2 B0 k
        BIX 与Bayk 的作用机制：8 S- R' c) W) i# @, e
   1、BIX: 在NPC的诱导试验中，进一步的研究表明在此过程中，G9a histone甲基转移酶受到抑制(G9a HMTase)后，重编程的水平大大提高了，BIX便是G9a HMTase的一种抑制剂，
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    2、Bayk 是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用。L-type calcium channels 在细胞内的不同组织内介导一系列的过程，如blood pressure regulation, smooth-muscle contractility, insulin secretion, cardiac development, 其通过CREB作用使Ca2+释放，改变cAMP水平，此外，Ca2+在mESCDE 增殖过程中也有着重要作用。* S8 w$ A" }  }0 I. F
        5 m  i/ v$ J8 g1 S
        BIX-01294 、BayK8644、Oct4和Klf4共同作用与小鼠的成纤维细胞的结果：
9 E7 ]! E% X8 y# g1 s; N0 l0 w2 x        仅用OCT4和Klf4得到的ipsc形态不明显，ALP也很弱，而且无法扩增，+ _. l. n, N2 a  l1 i  o2 N
        用OCT4和Klf4加上BIX处理，在此之后的14-21天内，得到强表达ALP的克隆，而且Nanog, Oct4, and SSEA-1也呈阳性，但其诱导率明显低于 Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc 4因子诱导和OCT4、Klf4、BIX联合诱导 NPC的过程，这个结果表明表观修饰在重编程的过程中也起着重要的作用。: N( I  b* Z# x) P. Y* V) O
        在OCT4和Klf4加上BIX的基础上，又添加了其它的小分子，结果又发现了5-azacytidine、RG108和BayK，前二者与BIX相似，是 DNA methyltransferase的抑制剂，后者是一种L-channel calciumagonist，它并不引起表观修饰，而是在信号转导方面起重要作用，而且在无BIX处理的过程中，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK是无法引起重编程的。
$ P* e; P! `" M7 G; l        4 ~1 c$ @9 S; X6 ~; l5 z# w# t- R
        进一步确定其多能性7 h# t6 m3 b- z! p: E
        用含Oct4-GFP reporter的MEF为材料，结果与上述相似，即仅用OCT4和Klf4、用OCT4和Klf4加上BIX处理时得到很少的克隆。用OCT4和Klf4加上BIX、BayK处理时得到较多的克隆，单纯依靠OCT4、Klf4和BayK无克隆形成。0 z. {5 E0 D+ I8 `& y# O
        检测其多能性：
# E6 I9 J: ^( G: {" \2 M# b1、DAPI、APK染色和 RT-PCR显示这些GFP+OK2B iPSCs 表达了典型的多能性标记： ALP, Nanog, Sox2, Oct4,SSEA1, c-Myc, eRas, Esg1, Ecat1, and Fgf4.
9 @  z8 S/ R2 X5 u0 D% C3 w2、Bisulphite genomic分析Nanog 启动子的去甲基化程度与ESC相当，与MEF想去甚远。
4 s. f( r( z3 E% a3、Transcriptome分析analysis showed that expression profile of OK2B iPSCs is greatly similar to the one of mESCs with a Pearson correlation value of 0.96, while significantly different to MEFs’ profile with a Pearson correlation value of 0.84 as exemplified in the clustering analysis$ O5 T: J; g2 g: x& ?/ v3 l
4、分化潜能:( W- A$ T2 N1 Y  w
      （1） 类胚体实验：对得到的EB用DAPI染色，显示三胚层均有分化：内胚层 (Albumin and Pdx1),中胚层 /心肌(CT3), 外胚层/neurons (bIII-tubulin, Tuj1).
+ i. F. R9 `% J      （2）2N囊胚注射：将ipsc注入8细胞期的囊胚中，再移植入同期的小鼠子宫中得到嵌合体小鼠，将得到的一个雄性嵌合体小鼠与野生型雌鼠杂交，得到的后代小鼠中得到了有LacZ+和Oct4-GFP+细胞的小鼠，说明该ipsc能整合到生殖系产生精子，证明了其全能性。

stonelee2050

可不可以具体的介绍一下你们的方法呢？具体步骤哦。

flydayzhu

被忽悠了，还以为是完全chemical的。。。。。

zerollx

回复 flydayzhu 的帖子
& j- G- j1 k7 Z2 S$ k
- u, l7 ]$ N* ]" I呵呵，那篇文章我也想要啊……

钻石星辰

你介绍的是08年Cell stem Cell上的文献。: ]4 ]; I/ V- I: s. p
, ?' P) m6 r8 X; k0 W( p/ z
目前iPS领域研究热点之一就是利用small molecules替代transcription factor，或者尽可能减少transcription factor的种类，特别是c-myc和klf4。
6 s, Q4 b  _- o; q( }9 [% `( H8 T. L* h4 Y
现在最新的文献已报道联合small molecules compounds可以仅仅导入单个转录因子Oct4就可诱导出iPS，不过效率很低。

zerollx

回复 stonelee2050 的帖子
7 r1 ]* a4 b/ n! i# x6 a  p8 ^5 p" N# h" c# Z" I1 E
这个文献里面有，仔细看看就知道了

flydayzhu

回复 zerollx 的帖子8 T' r/ s2 S, q* s+ s2 J

6 \: k$ G' D/ k+ @恩，谢谢~

scienese

老兄的题目有点歧义啊！

zerollx

嗯，没注意与最新的那篇文章区别开来，下次一定注意！！！！

fantafiction

请问BIX 与Bayk如何筛选找到的?