关于Splinkerette PCR的一些疑惑

钻石星辰

大家好，最近要开始做一些splinkerette PCR的实验。目的是检测transposon在genome中插入位点的位置和数量。
2 I0 z/ F2 a; u3 r
5 B% Z, H1 x7 p& P& h我查到一篇名为《Splinkerette PCR for Mapping Transposable Elements in Drosophila》,它的大致原理如图：$ J7 d; r+ _1 h" D% V

1 q% A1 w8 y2 f+ u5 N1. 全基因组DNA提取
( B, x4 O9 R6 l4 r0 h2. 限制性内切酶酶切全基因组DNA，获得"GATC"粘性末端
4 Y( U2 b3 @& h4 N3. 酶切好的DNA片段与splinkerette adaptor连接3 ~. b+ S- n4 `' a
4. 1st-Round PCR5 U$ ?7 P/ u2 X4 h9 R; D$ E# x2 z  L
5. 2nd-Round PCR
3 p3 s$ i, P6 y( D6. Sequencing! t3 ~9 U- B5 m3 {5 S
" P+ Q" E3 ]1 s& ^0 p
现在有一个问题比较困扰我：2nd-Round PCR的产物是直接拿去测序，还是先在胶上跑一下切胶回收再拿去测序？
2 z+ ~. l6 N6 R  f因为如果transposon的插入位点有2个以上的话，2nd-Round PCR的产物将是一个混合产物。这样不好测序吧？7 T6 ?4 V! H$ M
4 h/ I2 z2 x5 @" M4 S& \6 _
比较着急，希望高人指点。谢谢~
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+ c3 t# ~0 f, H0 ?( y+ v& X5 E附原始文献提供的splinkerette PCR Protocol

钻石星辰

回复 splinkerette 的帖子* M" x/ L8 r  u. g: @4 V  \' @
4 E( y- h, j  J' A8 t
谢谢您，这篇文章我有，不过后面的Sequencing Analysis没太弄明白就没深究了，没做过这方面的。。生疏一些，我再仔细看一看，不懂再请教您可以吗？

钻石星辰

% d/ x( Q7 y& e! i$ T6 d) s; i* ^$ u; T: y. G' ^
回复 splinkerette 的帖子7 `# G/ k3 t$ f! q

* T' |6 |% K/ W8 w你好，我看了那篇文献，出了后面高通量的测序方法没看懂其他基本没有什么问题了。因为我们的插入片段不会像病毒那么多，所以我们就直接电泳然后切胶回收测序就行了。
2 k/ `  f, R: |+ P
; o+ B! W4 s& U( F2 K6 [不过，我还有两个小问题：8 U% U* r* j! T" \

! s' T! ?4 V. ^9 ]; U! r1. 不过发现文献中的genomic digest体系配比中有一个“Acetylated” BSA。
1 ?0 B6 ~) s9 v9 O2 k5 A这种BSA在NEB中有提供吗？还是就是一般普通的BSA？
6 O! l4 E) B0 J1 Y* g7 {0 U# o
' [$ E9 M  E# ~4 _% m（没有用过NEB的酶不好意思）
1 n" N2 s, I; c! t4 J' ]! k/ u$ J; f6 P" v
2. 请问必须要用4%的胶来分离nest-PCR产物吗？其它浓度的可不可以？$ a* J/ ?: h% r. v, Y4 K* |2 j

! t1 {5 V( |) E; `/ a& n" @" B* q, y

钻石星辰

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# b4 u! M' f( w: E/ y7 A5 A$ {4 {7 b# z1 k" L! O& w# h- R3 j
谢谢！最近在设计引物，请问splinkeretter引物是哪一端不磷酸化的呢？是GATC末端吗？

钻石星辰

回复 splinkerette 的帖子- F/ x. S% ~- B

/ ~- X* s2 c7 e: h. V你好，请问我合成的splinkerette adaptor 没有按照Nature Method上要求的HPLC纯化，而是用PAGE纯化，对后续实验有影响吗？
  h6 l& x9 r+ x3 a+ g% g# m2 j1 t
; v1 U& c( M1 }* e# _5 I% u这两种纯化方式有什么不同呢？