请教关于转染后筛选阳性克隆的问题 - 病毒转染干细胞专区干细胞之家



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amanda2011

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楼主

发表于 2011-2-16 20:16 |只看该作者 |正序浏览 |打印

我用lipofectamine2000将EGFP质粒转染到人脐带间充质干细胞，转染效率很低，用G418筛选阳性克隆就更困难了，请问有没有做过相关实验的前辈，用lipofectamine2000转染方法如何提高一下阳性克隆数呢？

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发表于 2011-2-17 21:11 |只看该作者

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qingbao

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发表于 2011-2-17 12:12 |只看该作者

按照楼主描述的情况，我来猜测一下。虽然我没有做过间充质干细胞的转染，不过从一般细胞系的转染来看：估计还是用脂质体转染只是换一种类型的试剂应该是换汤不换药，不会有很大的改善。楼上说的有道理，一般来说电转和病毒转在效率上比脂质体转要高。
另外，如果转染当初阳性率就很低的话，后续的稳定压力筛选基本不用考虑往下做，最后应该是拿不到阳性克隆的。孤零零的几个细胞在压力条件下很难保持良好的状态活下去。

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jefferson

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发表于 2011-2-16 22:32 |只看该作者

本帖最后由 jefferson 于 2011-2-16 22:34 编辑 0 _; l7 B& @1 H/ E! Z: ^" @

间充质细胞是比较难转染的.一般电转和核转用的比较多,或者用病毒,楼主有条件的话最好做电转或核转.3 q9 W$ ?( v$ {! }& Y9 M
# F6 h% ?; O: b$ j8 I8 e, R& A
如果做普通转染,建议楼主先比较下几种转染试剂的效率,Lipo2000, Fugene6, Fugene HD等,不同的试剂对不同细胞类型的转染效率是不同的. 比如对293T细胞, Lipo2000比Fugene6要好, 而对Plat-E细胞,虽然也来源于293细胞,但Fugene6就比Lipo2000好了.2 ^ L; X6 |- h: V

此外,Invitrogen公司去年新开发了一种试剂, Lipofectamine LTX, 比Lipo2000效率更高的同时,细胞毒性更低, 可以允许相同细胞数目下加大DNA量和转染试剂的量, 这样也能达到提高转染效率的目的. 当然了,价格也近乎是Lipo2000 的一倍.