请教关于转染后筛选阳性克隆的问题

amanda2011

我用lipofectamine2000将EGFP质粒转染到人脐带间充质干细胞，转染效率很低，用G418筛选阳性克隆就更困难了，请问有没有做过相关实验的前辈，用lipofectamine2000转染方法如何提高一下阳性克隆数呢？

64627675

这个也太难了点吧，从来不敢想用质粒转染间充质细胞能有高效率，个人建议用慢病毒，仅供参考，当然可能也有高手可以做到吧，不过我没见到过

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这个也太难了点吧，从来不敢想用质粒转染间充质细胞能有高效率，个人建议用慢病毒，仅供参考，当然可能也有高手可以做到吧，不过我没见到过

jefferson

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间充质细胞是比较难转染的.一般电转和核转用的比较多,或者用病毒,楼主有条件的话最好做电转或核转.- d+ P$ a: j; y4 d8 E: F% p% `
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如果做普通转染,建议楼主先比较下几种转染试剂的效率,Lipo2000, Fugene6, Fugene HD等,不同的试剂对不同细胞类型的转染效率是不同的. 比如对293T细胞, Lipo2000比Fugene6要好, 而对Plat-E细胞,虽然也来源于293细胞,但Fugene6就比Lipo2000好了.3 k8 `$ ?+ s$ {1 ~( l7 v" l

% ?# b% W, |7 J0 D此外,Invitrogen公司去年新开发了一种试剂, Lipofectamine LTX, 比Lipo2000效率更高的同时,细胞毒性更低, 可以允许相同细胞数目下加大DNA量和转染试剂的量, 这样也能达到提高转染效率的目的. 当然了,价格也近乎是Lipo2000 的一倍.

qingbao

按照楼主描述的情况，我来猜测一下。虽然我没有做过间充质干细胞的转染，不过从一般细胞系的转染来看：估计还是用脂质体转染只是换一种类型的试剂应该是换汤不换药，不会有很大的改善。楼上说的有道理，一般来说电转和病毒转在效率上比脂质体转要高。
& D, e7 O) S( q! l$ V5 q1 ^另外，如果转染当初阳性率就很低的话，后续的稳定压力筛选基本不用考虑往下做，最后应该是拿不到阳性克隆的。孤零零的几个细胞在压力条件下很难保持良好的状态活下去。

amanda2011

非常感谢