|
- 积分
- 5
- 威望
- 5
- 包包
- 38
|
DC-CIK细胞的制备方法
# C: K, k& g% P# |! M【背景】
7 M( L7 v; A: U: m CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-,IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前临床上广泛使用的过继性免疫治疗细胞。
9 M2 X: ]7 X8 H- I0 ~ tDC是“Dendritic Cells”的缩写，中文全称为“树突状细胞”，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是由2011年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家RalphM. Steinman于1973年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC是唯一能够显著刺激初始T细胞(Naïve T cells)增殖的APC，而其它APC(如单核巨噬细胞，B细胞等)仅能刺激已活化的或记忆性的T细胞。DC是机体适应性T细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。
" x4 a9 P4 Y. x DC-CIK即DC和CIK细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细胞是经DC体外活化的CIK细胞。多项研究表明，DC与CIK具有协同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而CIK的增殖能力和体内外细胞毒活性也得以增强，因此DC-CIK较单独的CIK治疗更为有效。若将肿瘤抗原负载的DC与CIK共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的T细胞，这样的DC-CIK治疗则兼具特异性和非特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更强，常被用于临床和科研。( v# V6 ~+ y5 r; h+ O6 A
【培养原理】: l3 @* r3 j2 b) n
1．DC培养用细胞因子：7 S. D5 r# {) P' Q B0 l: n
GM-CSF( 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 ) ：& o M# E5 f$ d( B( R
GM-CSF是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成，并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的 功能。GM-CSF是最早被鉴定出来对于DC有作用的细胞因子之一。GM-CSF在DC培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面MHC II类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。 此外，GM-CSF还可促进DC的存活。
, r4 p7 {' f4 ^! uIL-4 ( 白细胞介素- 4)3 t, Y& x+ D; g! v6 H& A$ A
IL-4在由单核细胞诱导成DC的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从而引导单核细胞向DC方向分化。若培养体系中不加IL-4，单核细胞将分化为巨噬细胞。同时，IL-4还有降低细胞表面表达CD14分子的能力。CD14表达水平的降低是单核细胞分化为DC的重要标志。GM-CSF和IL-4共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟DC(immature DC)，此时的DC具有较强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)， 但不表达CD14。2 [ u0 `+ A! F3 ?, C" f
TNF-( 肿瘤坏死因子- )6 n+ W. w& j/ |8 }8 Q$ _" s
TNF-可下调未成熟DC的巨胞饮作用和表面Fc受体的表达，使细胞内MHC II类分子区室(class II compartment)消失，但能够上调细胞表面 MHC I类、II类分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表达，使未成熟DC分化为成熟DC(mature DC)，此时DC的抗原摄取和加工能力明显减弱，而抗原递呈能力显著增强，可极强的激活T细胞。
1 _; K8 g3 @& s T9 p2．CIK培养用细胞因子和抗体：
2 C1 E, r1 K, i- pCD3 激发型单抗：
0 N, U- g- r. [$ z* hT细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶 (Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸 (Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能 够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺激因素。 此外，CD3激发型单抗在选用时一定要注意克隆号。研究表明，仅克隆号为OKT-3的CD3激发型单抗可以刺激所有人的T细胞的增殖，而其它克隆号的CD3激发型单抗仅能刺激一部分人的T细胞。因此，在进行CIK培养时，最好选用OKT-3克隆，以保证每个患者的T细胞均能被激活。
4 c( e# P2 T" w* w" U IL-2 ( 白细胞介素- 2)7 n, D# d6 \+ G3 E" E5 a1 A+ }
IL-2最初发现时被称为T细胞生长因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T细胞增殖最重要的细胞因子。IL-2既是自分泌细胞因子，也是旁分泌细胞因子，其通过与T细胞表面的IL-2受体(IL-2R)的特异性结合而促使T细胞活化，并进入细胞分裂状态。此外，IL-2还可刺激NK细胞的生长并增强其杀伤能力。因此CIK细胞培养中须添加IL-2，以促进T细胞的增殖与活化。1 Y# `: B4 ~% N; F; b: C" a; [- |1 o
IFN-( 干扰素 -)+ l: A- R& V+ N. E9 i' d- s
IFN-;具有上调外周血淋巴细胞表面IL-2R表达的作用，因此会增强T细胞对IL-2促增殖反应的敏感度和强度。在诱导CIK细胞形成的过程中加入IFN- ，可降低IL-2的用量。研究发现，IFN-加入的顺序与CIK的细胞毒活性密切相关。先加入IFN-，培养24后再加入IL-2，可明显提高CIK的细胞毒活性。
4 s& `- `0 a9 `IL-1- (白细胞介素- 1)
6 I$ d: A! c- G- wIL-1也可以介导外周血淋巴细胞表面上调表达IL-2R。当IL-1与IFN-和激发型CD3单抗合用时，可以明显提高CIK 的细胞毒作用。
& R6 U; _2 n. P【细胞制备】) F6 A# L$ l, ~0 u& ^+ d2 b/ B
1． 外周血单个核细胞的采集( e. i* @8 W( b( x2 c
1.1 用血细胞分离机采集患者自身的外周血单个核细胞80 - 100ml；
# Z/ S5 e$ y: i 1.2 淋巴细胞分离液密度梯度离心法进一步纯化单个核细胞(PBMC)。3 U7 A! _- Y; Y; p& Q
1.3 无血清培养液洗涤2次，获得纯度在90%以上的PBMC，细胞数量需达到1-3 x 108。$ ^0 p( j% [1 F; k
2． ( 可选步骤) 肿瘤抗原的制备
* k- y0 ?) V# Y, |+ k 用于负载DC的肿瘤抗原可以是肿瘤特异性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或肿瘤相关抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是肿瘤全细胞抗原。用TSA或TAA负载的DC具有很好 可克服这些缺陷，因为此时无需知道那些抗原是肿瘤细胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多种不同肿瘤抗原冲击DC可诱导产生针对不同抗原决定簇的细胞毒T 淋巴细胞(CTL)克隆， 从而实现对肿瘤细胞的有效杀伤。肿瘤细胞全抗原负载DC的方法很多，包括用肿瘤细胞裂解液负载DC、用凋亡肿瘤细胞负载DC、用坏死或死亡的肿瘤细胞负载DC，用肿瘤 活细胞负载DC，和将肿瘤细胞与DC融合等。目前临床上常用的是用肿瘤细胞裂解液负载DC，因该方法简单、快速、有效。反复冻融是获得肿瘤细胞裂解液的常见方法，具体步骤如下：
) h$ a& ~6 I: Z3 ?# g; O 2.1 手术切除肿瘤标本，无菌条件下，将坏死组织和癌旁非肿瘤组织去除干净；6 _# f+ W r9 |( _. @
2.2 无菌生理盐水洗3次；
4 S! i; @% o! d; u; B) R 2.3 用无菌的组织剪将肿瘤组织剪碎，加入RPMI 1640培养基，充分研磨；6 d; R2 X( F/ R, f4 {9 E
2.4 200目无菌网过滤后收集单细胞悬液；
7 ~8 ]% O! }$ T. P% L4 F4 R 2.5 用RPMI 1640培养基重悬细胞至1-2 x 107/ml，装入5ml无菌冻存管中；0 I- ^9 Q7 Z7 R6 F$ u
2.6 将冻存管浸入液氮中速冻，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解冻10 min。反复3-5次；& c- c$ k( Z- t, `/ e* `& [
注：也可以 -80oC/37oC 反复冻融 3-5 次。/ c( L1 E; p5 o: u+ Z' {
2.7 将肿瘤裂解物加入离心管中，3000rpm，离心10min；0 ^0 S: i) }; Y' V5 `" s; h1 z
2.8 收取上清，0.22mm滤膜过滤除菌，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体；
1 B! D- r( a) D. q 2.9 -80oC保存备用。
) h" Y+ l- @8 a' y0 c9 \) t7 w4 R3 f4 e
3细胞的培养及鉴定
% S W. m5 q! S) I4 j' l 3.1 步骤1中获得的PBMC 用无血清培养液调整细胞浓度至2 x 106/ml，置于培养瓶内；# |8 ~& j F+ q3 s$ D- K- D
3.2 37℃，5%CO2培养箱中孵育2h，以使单核细胞贴壁;8 {8 n1 _( v, {! c" D0 u
3.3 收集悬浮细胞，． CIK用无血清培养液调整细胞浓度至1-2 x 106/ml；0 Y: F9 D( v J4 P
3.4 加入1,000 U/ml 的重组人IFN-g培养；9 j0 _& C# t5 ~
3.5 24h 后加入50ng/ml 的CD3 单克隆抗体和300 U/ml 的重组人IL-2，刺激CIK 细胞的生长和增殖；% V' }, T' |2 G" \0 y. V8 ~% c0 ^
注：此时也可同时加入 100 U/ml 的重组人 IL-1 。
8 P1 ]8 }! |# X' p0 Z 3.6 每3天半量换液或扩瓶一次，并补加重组人IL-2 300 U/ml；% f5 ~ E1 ^6 e+ w% V9 n* ?( }
3.7 在培养的第7d，收获CIK细胞，此时数量应达到1x 109个以上。
$ ^$ a4 S" @4 P 3.8 CIK细胞质控：
6 _7 C& |; \! C7 T1 N1 k% { 3.8.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；; _+ Y' ^* _; o- }( T$ F! `. T3 r2 t: w$ t0 _
3.8.2 用流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8和CD56 等分子的表达，观察CD3+CD56+细胞的比例是否明( j; U A1 O# O
显提高。
( p4 N3 `+ L5 H2 ?- P ) D1 p5 ?4 r2 s& j
4． DC 细胞的培养及鉴定3 S, Y: V$ ~ n& E, v
4.1 步骤3.2中剩下的贴壁细胞(主要是CD14+的单核细胞)，加入含重组人GM-CSF 500-1,000U/ml和重组人" v+ Q. g* f3 w( F/ H! H
IL-4 500U/ml的无血清培养液，37℃，5%CO2培养箱中培养，诱导单核细胞向DC细胞分化；4 E7 ~& a- U# `7 c2 B; n+ b
4.2 每3d 半量换液一次，并补足细胞因子；
) k. N; ?0 B1 X+ J' q: w; Q4 G 4.3 (可选步骤) 在培养的第5d， 加入步骤2中获得的肿瘤抗原50 mg/ml，对DC进行抗原负载；7 _+ w9 j+ u3 A
注：若不对 DC 进行抗原负载，该步省略。0 F( [! H6 i; s" V$ x! j, c1 y
4.4 在培养的第6d，加入重组人TNF-α(500U/ml)，诱导DC 细胞成熟；. G4 d8 T( P' \' L
4.5 在培养的第7d或第8d，收获DC 细胞，其数量应达到1×106个以上；8 A" w$ I! ~; M+ o' Y
4.6 DC的质检：+ Q) J. ?' J( I8 }4 ~* }
4.6.1 台盼蓝染色检测细胞活力：活细胞应在80%以上；9 i& ~) p$ l. @
4.6.2 流式细胞仪检测DC 细胞表面HLA-DR、CD83 和CD86 等分子的表达，以确定DC是否成熟。
& Q) `$ w: n$ k+ W* V
' ~8 X1 g7 K9 V$ U( s7 l7 l6 B, Y5. DC-CIK细胞的制备和质检8 V, k& J9 ~, I8 E
5.1 收集步骤4和步骤3中所获得的DC 细胞和CIK 细胞，按1∶10 (数目比)的比例共培养，无血清培养液中添
/ a; S* x5 S& ^$ r- s# \ 加重组人IL-2 (300 U/ml)；0 E; f5 N0 H% E _" _; |. i
5.2 每3天半量换液一次，并补加重组人IL-2 (300U/ml)。
" C' b- a$ S3 C% p6 N 5.3 在第7d 收集细胞，细胞数量应达到1×1010个以上；
2 M: K& e; i& \4 q0 q r# W( Q 5.4 DC-CIK细胞的质检：* B/ |& l: u3 u6 `( V2 S1 i$ x
5.4.1 台盼蓝染色检测：活细胞应在80%以上；
" e6 m+ d% I7 Z! w) X' R7 v" v) M. D 5.4.2 流式细胞仪检测细胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表达：CD3+CD56+细胞的比例应在20%
9 E0 z K' ?% W* D 以上。- b! n" a+ E7 p5 a
5.4.3 细胞杀伤实验：以DC-CIK细胞为效应细胞，以肿瘤细胞(可为原代肿瘤细胞或肿瘤细胞株)为靶
! p" P2 l% a0 R% S8 h* a9 y5 N, W 细胞，将效应细胞与靶细胞按10 :1(数目比) 的比例加入96 孔U型板中，每孔含靶细胞 1 x 104
6 G) n' }% ?% F* q3 A 个，终体积 为200ml，设3个复孔。培养4h，然后取培养上清，用乳酸脱氢酶(LDH) 试剂盒检
1 @& u2 w7 U- W+ z7 ` 测效应细胞对靶细胞的杀伤率。
9 V9 X5 M0 K! Q+ [" ^ 5.4.4 收获细胞前，取少量培养物进行细菌、真菌培养，并检测支原体、衣原体，及内毒素(标准：病" d: Q1 [1 y+ F' P+ q2 x3 `! }
原学检测阴性，内毒素<5 Eu)。
h! K9 t8 k0 B& ~1 f【步骤简图】
* G! i9 }0 y5 m2 `$ G4 N2 i$ |! ]4 U 4 e5 w' y. }/ d% e' i6 j6 |
|
-
总评分: 包包 + 5
查看全部评分
|
发表于 2014-7-31 08:45
