关于丝裂霉素处理MEF

wangyimei

还有一个问题就是关于丝裂霉素的配制和保存的问题* @( j; [8 m. D5 p2 R+ S# q
一 是不是得配成一定浓度的储存液啊，配完之后是避光四度保存吗，还是-20度保存，看说明书都是四度保存的，四度要是保存时间长了，是不是也会有降解？
" T" |) R7 _2 S& t$ @9 k$ ?二是 我用10微克/ml的浓度处理3-4hours后，怎么看其是否还在增殖，只是用眼睛大概看一下细胞是否变密了没有吗？是否用做生长曲线来摸一下丝裂霉素C的浓度和时间？要是处理ICR MEF的话直接用文献上的浓度和时间是否可以，大家一般都是用的什么浓度和时间的？
3 _+ }. z2 V. _1 \! i5 V三是 要是每次收集10ml的MEF-conditioned medium,一般是种多少细胞收集10ml的条件陪养液啊？

zerollx

1、用DMEM 配成储存液、分装小管、-20度保存。用的时候取储存液用DMEM稀释至工作浓度，避光4度保存，最好在短期内用完。/ |: \1 D3 ^. r2 O
2、一般10微克/ml的浓度处理2个半小时就可以了，刚做的时候不放心的话你可以处理后接种到皿后，观察几天其不增殖基本上就可以确定了，没有必要做生长曲线，当然若是在不放心的话可以做个曲线。一般这个条件基本上是不会有问题的。0 g2 u$ e" F1 P* I6 c: E
    第三个问题我没做过，就回答不了了，但你若是收集MEF-conditioned medium，有一个很重要的一点是丝裂霉素处理后一定要洗干净，否则残留的丝裂霉素对ESC是有害的。

wangyimei

恩，谢谢你的指导和解答，还有一个问题就是：丝裂霉素C处理后，用PBS洗5遍之后，是直接将ips细胞接种到上面，还是说将处理后的MEF用胰蛋白酶消化下来再以一定的密度接种到平皿中，待其融合至合适的密度后再将转导后的细胞接种其上？

zerollx

都行，也可以一次用MMC处理很多的MEF后，冻起来，用的时候再接种合适的密度，待其贴壁后直接用，不过处理的MEF是有最佳使用时间的，最好在5天内使用。

wangyimei

恩，好的

你好好

大家都是买的哪家公司的？
; C- W: v! R. {% m$ m) ?. [查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353
' R, f' I3 ^" Q0 o# {* X6 ]' i9 G- d2 c5 p
大家都用那个货号？: z- r# e' Y7 z0 P( e# ?

: t9 r4 N( t; f6 X" s

wangyimei

之前我用的是SIGMA的，价钱昂贵，而且丝裂霉素最好是现用现配，对光也比较敏感，配完后要赶快用完；
9 |3 d# ]" x0 I* g现在用的基本上都是从医院买的，几十块钱，用着还行

573639471

你好好 发表于 2011-3-10 15:01
: k' m- l# u9 R5 E1 Q' C大家都是买的哪家公司的？7 W+ V; o! N; c, E+ J
查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353

& o& _4 W3 l& a. D3 @你好，你最终订的哪种啊，我现在订了M4287，以后多多交流吧

zsycgz

我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科研“富二代”例外。。。:D% `( `/ B6 d. |% I1 D

6 O  H' x& D* ^# [' G/ u补充内容 (2011-4-15 16:32):
  {, c, ^- {  i- ~. A- d+ z以前也一直用，效果可以啊

573639471

zsycgz 发表于 2011-4-15 16:31 / y; u8 [  i' N' z9 ^! U/ [5 r0 M
我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科 ...

6 x' t0 l2 L7 o" v5 A* V8 d0 v我正打算从医院买，医院卖的只有一种还是有不同的标准，如果有不同的型号的，要选择哪种呢？