关于丝裂霉素处理MEF

wangyimei

还有一个问题就是关于丝裂霉素的配制和保存的问题
; B* \+ v" d. S) ~, w! T. |1 T一 是不是得配成一定浓度的储存液啊，配完之后是避光四度保存吗，还是-20度保存，看说明书都是四度保存的，四度要是保存时间长了，是不是也会有降解？5 s/ P5 [/ H( A. B7 y  Y
二是 我用10微克/ml的浓度处理3-4hours后，怎么看其是否还在增殖，只是用眼睛大概看一下细胞是否变密了没有吗？是否用做生长曲线来摸一下丝裂霉素C的浓度和时间？要是处理ICR MEF的话直接用文献上的浓度和时间是否可以，大家一般都是用的什么浓度和时间的？* u( \3 B3 D. ]" E
三是 要是每次收集10ml的MEF-conditioned medium,一般是种多少细胞收集10ml的条件陪养液啊？

zerollx

1、用DMEM 配成储存液、分装小管、-20度保存。用的时候取储存液用DMEM稀释至工作浓度，避光4度保存，最好在短期内用完。
! Z1 f+ a$ N- E* E* T' h# }2、一般10微克/ml的浓度处理2个半小时就可以了，刚做的时候不放心的话你可以处理后接种到皿后，观察几天其不增殖基本上就可以确定了，没有必要做生长曲线，当然若是在不放心的话可以做个曲线。一般这个条件基本上是不会有问题的。
8 U5 I/ K. N- F, A- L3 ]) I: R    第三个问题我没做过，就回答不了了，但你若是收集MEF-conditioned medium，有一个很重要的一点是丝裂霉素处理后一定要洗干净，否则残留的丝裂霉素对ESC是有害的。

wangyimei

恩，谢谢你的指导和解答，还有一个问题就是：丝裂霉素C处理后，用PBS洗5遍之后，是直接将ips细胞接种到上面，还是说将处理后的MEF用胰蛋白酶消化下来再以一定的密度接种到平皿中，待其融合至合适的密度后再将转导后的细胞接种其上？

zerollx

都行，也可以一次用MMC处理很多的MEF后，冻起来，用的时候再接种合适的密度，待其贴壁后直接用，不过处理的MEF是有最佳使用时间的，最好在5天内使用。

wangyimei

恩，好的

你好好

大家都是买的哪家公司的？' j; V% R3 |, e0 }- `- z, s4 S- _4 w
查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353! p# R/ l# H% F: z8 Z
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大家都用那个货号？
- \# a# L  B! U8 v! i' w: m8 ~4 {4 X. p8 ], p1 G6 F6 d; A

wangyimei

之前我用的是SIGMA的，价钱昂贵，而且丝裂霉素最好是现用现配，对光也比较敏感，配完后要赶快用完；% e8 H& ]$ e8 v0 b- T" q
现在用的基本上都是从医院买的，几十块钱，用着还行

573639471

你好好 发表于 2011-3-10 15:01
1 s* Z% K+ W* T! F) O大家都是买的哪家公司的？" s/ P5 B' f. \3 \6 X2 `  [3 |; i
查到有SIGMA的，有两种，M4287和M0353

4 H& S# M1 H) a! p1 \! A你好，你最终订的哪种啊，我现在订了M4287，以后多多交流吧

zsycgz

我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科研“富二代”例外。。。:D
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" i6 Q% b8 a7 X* {9 M' W' }3 X. M补充内容 (2011-4-15 16:32):
8 y/ Z; O* b, ]" D以前也一直用，效果可以啊

573639471

zsycgz 发表于 2011-4-15 16:31
5 a7 s5 C/ v, ]; I我们用医院购买的，我们医院的2mg一支的，9.75元一支，不贵。今天刚买完。没必要这个也用sigma的吧？当然科 ...

( s! E$ e$ z$ m5 N% Y( i2 z! p& R. O
我正打算从医院买，医院卖的只有一种还是有不同的标准，如果有不同的型号的，要选择哪种呢？