western的marker转不上？

张也行

各位高手好... ...4 D; M9 V3 k/ E
这两天做western的时候发现转膜的时候marker老是转不上，湿法转膜，新的缓冲液。加了5-6ul的marker，在胶上明显能看出来。目的蛋白最后能出来（上样20ug-40ug）。转膜100V，一个小时。
/ z* k$ @8 N5 ?6 ]会和滤纸有关吗？用了很多次了，但是目的蛋白好像没有问题。滤纸大小必须和胶的大小一致吗？比胶大会短路吗？

siyue13

WB的话，多调整一下条件试试吧

aminhair

小分子量的蛋白就缩短时间嘛。这都是可变的。没有一沉不变的东西哦！要摸条件的。呵呵。有事后转过头，有时候转不过去。这样你慢慢就了解到你研究的蛋白的特性了。甚至要查很多文献，有些蛋白是多聚体，所以不要单纯看单体形态，还有磷酸化等修饰啊。看看别人报道的怎么样。呵呵

张也行

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/ }4 U" K: ]; J. U% r
6 ^; S  l$ }) d我上次说错了，我用的就是prestained marker，不用染的。呵呵... ...

张也行

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) u2 i% b- ^$ K& F, A* C
. w2 M% A2 M& O( b# m, ^哈哈 谢谢你，我今天试一下... ...
) V. b* Y9 J0 g+ H$ L% O" x  F+ v有结果了再给你回复... ...

Chunjieliu

1．        首先，应排除maker的自身问题，可以向试剂公司要一些其他maker的试用装，比较一下转模效果。
5 m1 P0 Z4 c' z$ G, V. m. w2．        其次，可以优化一下转模的条件，比如电压调整至110-120V，时间可延长至2-3h。) a4 _5 r) i7 s. V) x7 c- M. u$ b+ E
3．        第三，滤纸不应过大，可以使滤纸大小略小于胶的大小，这样两层滤纸之间就会被胶隔开，从而避免短路。
! [& c0 ^! A0 e5 _

张也行

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, o: H" j4 [% z
& R3 `: `5 ^. N( z3 n  b2 R谢谢，不过“使用低恒压长时间（12h）”好吗？时间太长对蛋白不好吧？小蛋白容易弥散啊... ...

jefferson

张也行 发表于 2011-3-4 13:06 / e0 u# R3 N6 g9 [7 w+ y6 f  j! i
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# P# `3 ]1 D1 M3 a( V! q" X$ F6 w$ S6 T* W
谢谢你！ 我做的时候一般最边上的那个孔不用。用的是普通的marker

0 M" n4 ^9 L' t4 O最大的两条带在胶上是正常的, 100v转1个小时,最大的条带很难转到膜上的. 下面20-50KD的是可以转.
/ L9 ]- H' G* x8 e% I7 n
0 k8 m6 l$ ^& \" H. ^, v至于小条带胶上没有膜上也没有就有点蹊跷, 是不是你Marker质量有问题.或者转膜效率不高, 染不出来. 有时普通Marker的确不怎么好染, 染出来的效果比较差,所以我们现在都用预览Marker.如果你有预览Marker最好,用预览Marker跑了后转的,直接能看到, 不用染.
) ^, I8 K  v- k, v' d5 J
" c  B+ ?2 ~1 K( r  y* M0 B% c你可以用120V转90分钟试的再看下,一面胶的电流一般是200-300mA, 两面胶大概300接近400. 这个电压和时间下, 50KD左右的蛋白都可以完全转膜.

张也行

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2 @9 l" d% K2 Z  t. g- v9 G
1 ]" [; F& `" e1 t3 [谢谢你！ 我做的时候一般最边上的那个孔不用。用的是普通的marker# I7 k6 L8 E* V# F
问题的关键是，最大的那两条带还在胶上，下面的20-50KD的marker条带胶上没有，膜上没有，滤纸上也不明显。PAGE胶最下面的溴酚蓝转膜后在膜上也不明显。很诡异... ...

aminhair

第一：避免在三明治结构中气泡的存在；第二：使用低恒压长时间（12h），低温转膜；第三：便捷的方法就是，直接咨询marker厂商，问他们相关的参数，特性等。第四:从头检查在western中所使用的各种材料的特性（包括，膜的种类，处理方法，转膜槽的参数等）。祝实验顺利！