western的marker转不上？

张也行

各位高手好... ...4 i2 a, |9 g. z8 K- h/ N
这两天做western的时候发现转膜的时候marker老是转不上，湿法转膜，新的缓冲液。加了5-6ul的marker，在胶上明显能看出来。目的蛋白最后能出来（上样20ug-40ug）。转膜100V，一个小时。. m" R( r  V4 I  A* {" A
会和滤纸有关吗？用了很多次了，但是目的蛋白好像没有问题。滤纸大小必须和胶的大小一致吗？比胶大会短路吗？

jefferson

是预览Marker 还是普通Marker? 这个批次的Marker之前用能转的上吗? 首先排除Marker自身问题.
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你的Marker是否是点在最边上的泳道? 如果在最边上有可能是你的滤纸比膜小, Marker那里没有闭合导致的. 或者边缘位置的膜和胶没贴紧,有气泡, 所以转不过去. 你把Marker点在中间位置看看情况.
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很多人说滤纸不能大于胶,否则短路. 我做WB用的滤纸向来都是比胶大的, 覆盖后把胶整个包夹在内部,做出来的挺好, 你也可以试试

aminhair

第一：避免在三明治结构中气泡的存在；第二：使用低恒压长时间（12h），低温转膜；第三：便捷的方法就是，直接咨询marker厂商，问他们相关的参数，特性等。第四:从头检查在western中所使用的各种材料的特性（包括，膜的种类，处理方法，转膜槽的参数等）。祝实验顺利！

张也行

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谢谢你！ 我做的时候一般最边上的那个孔不用。用的是普通的marker
3 u5 T2 ?' c# W0 R- y问题的关键是，最大的那两条带还在胶上，下面的20-50KD的marker条带胶上没有，膜上没有，滤纸上也不明显。PAGE胶最下面的溴酚蓝转膜后在膜上也不明显。很诡异... ...

jefferson

张也行 发表于 2011-3-4 13:06
: Z: x3 Q. g6 [! u回复 jefferson 的帖子0 f) ~2 ^' J* @& M" s! A
0 @7 U9 a6 ]* z8 k5 ]0 ~; {9 D
谢谢你！ 我做的时候一般最边上的那个孔不用。用的是普通的marker

. J$ W) K# F5 s$ X4 o/ V最大的两条带在胶上是正常的, 100v转1个小时,最大的条带很难转到膜上的. 下面20-50KD的是可以转.
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1 z, J6 z. i- N9 Q% o8 p至于小条带胶上没有膜上也没有就有点蹊跷, 是不是你Marker质量有问题.或者转膜效率不高, 染不出来. 有时普通Marker的确不怎么好染, 染出来的效果比较差,所以我们现在都用预览Marker.如果你有预览Marker最好,用预览Marker跑了后转的,直接能看到, 不用染. & v" P6 l* w. d0 r" ^
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你可以用120V转90分钟试的再看下,一面胶的电流一般是200-300mA, 两面胶大概300接近400. 这个电压和时间下, 50KD左右的蛋白都可以完全转膜.

张也行

回复 aminhair 的帖子5 D5 g! z! Y" L
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谢谢，不过“使用低恒压长时间（12h）”好吗？时间太长对蛋白不好吧？小蛋白容易弥散啊... ...

Chunjieliu

1．        首先，应排除maker的自身问题，可以向试剂公司要一些其他maker的试用装，比较一下转模效果。1 }1 x+ S# a, ?7 d: m* e* h0 P
2．        其次，可以优化一下转模的条件，比如电压调整至110-120V，时间可延长至2-3h。
2 {! c) n+ r  g+ [' m# |4 G3．        第三，滤纸不应过大，可以使滤纸大小略小于胶的大小，这样两层滤纸之间就会被胶隔开，从而避免短路。: X6 p' S- R  x: f0 K$ L

张也行

回复 jefferson 的帖子: A! b+ r# L6 _' [8 @

, g0 l2 W" }# T6 C8 T哈哈 谢谢你，我今天试一下... ...
  W7 _4 U/ \* e, ]& A( [有结果了再给你回复... ...

张也行

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: J5 x& p2 H7 r2 Q% c8 K
, M+ M' Z9 P$ y我上次说错了，我用的就是prestained marker，不用染的。呵呵... ...

aminhair

小分子量的蛋白就缩短时间嘛。这都是可变的。没有一沉不变的东西哦！要摸条件的。呵呵。有事后转过头，有时候转不过去。这样你慢慢就了解到你研究的蛋白的特性了。甚至要查很多文献，有些蛋白是多聚体，所以不要单纯看单体形态，还有磷酸化等修饰啊。看看别人报道的怎么样。呵呵