求教：如何提高脂质体lipofectamine TM 2000的转染效率

细胞海洋

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xvmengdi

我是一名新手，刚刚开始做转染实验，我想请教一个问题，用脂质体转染细胞后，细胞内会有黑点，我上网查呃一下，属于正常情况，可是转染24小时后细胞变成贴壁的粒状物质，想不明白这样的细胞还可以做荧光素酶报告基因实验吗？非常感谢~

runsong

你为啥要用IRES载体，这种载体的GFP表达效率不高，而且转染两三天后可能会莫名其妙地失活。建议你用EGFP-C1做对照，再看看筛选效率如何。
! r6 M+ e7 f! n% F8 v转染其实没啥技巧，我感觉对于转染效率，脂质体质量、细胞种类状态、操作水平各占45%、45%、10%的权重。
3 O7 S! p( V$ [* s. Y$ z0 u6 \. y+ q脂质体假货很多，三支中可能只有一支给力。呵呵，买试剂的都是奸商。

crystal

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" C: @, h( x& q, \2 i' J: A1 H* X2 [/ w5 c6 i( J0 i8 `3 I, u6 ^
hela细胞，很好做的一个细胞株！

mckf111

回复 crystal 的帖子% f+ c% s1 @) d5 H; s# \

+ y7 B. L2 p" e# f什么细胞啊 这么高的效率。。

crystal

回复 mckf111 的帖子% W- ~: M1 F6 r/ i' M
0 Z1 I  B  N" @" K4 i" n" P
大概80多的样子吧。

fendou9

转染还是要看具体情况的  建议提高脂质体也质粒的比例

mckf111

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# c, f  D- z) H/ Q3 I/ C7 w4 ^
5 x0 B* O8 T% l' _* G你的转染效率如何啊？

crystal

最近刚做了转染，有点小小的想法，不知道是否合理：1 o" {- r6 p2 a" j( |
种板的时候，每孔细胞的浓度不一，这样等到汇合达到分别达到70%，80%，90%的时候进行转染，然后再根据转染效果看看，你的细胞在多少密度和汇合达百分之多少的时候转染率最高！再有就是分别调整DNA/LIPO的比例，你可以1/1.25和2/2这样做几个孔试试看，这样也许也能测得你所转染的最佳比例，自己想的，不知道对不对！

qingbao

稳定筛选的原理：0 c+ P7 ~; r8 a5 `) y
被转染的质粒DNA带有可供筛选的标记基因，如胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因或者新霉素磷酸转移酶基因等。当携带相应抗性基因的质粒在被转染的细胞内表达后，用相应的抗性药物即可将转染细胞筛选出来。在真核细胞中以新霉素抗性基因比较常见。% j1 h/ U' @# w( t5 j' i5 P" P
新霉素抗性基因来源于转座子Tn5，其编码的细菌磷酸转移酶可使筛选药物G418失活。G418属氨基甙类抗生素，作用于80S核糖体可抑制蛋白质的合成。因此，未转染的细胞可被G418杀死，转染细胞却能够存活。真核细胞对G418的敏感性存在广泛差异。G418的使用浓度从100～1000μg/ml不等。所以，在使用G418筛选细胞之前，应将待试细胞置于含不同浓度G418的培养液中，以在3～6d杀死细胞的G418浓度为最佳。一般来说，细胞分裂越快，越容易被G418杀死。: k) q  h! W- z, `3 F