求教：如何提高脂质体lipofectamine TM 2000的转染效率

qingbao

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1）在根据转染试剂说明书要求的融合度时转染，一般70%左右即可。）但是因为细胞生长速度不同，所以还要确定细胞转染48小时后或是新霉素筛选前才长满。因为生长接触抑制会降低目的基因的表达。3）确定细胞在转染后48小时以及药物筛选过程中生长状态良好。如果在瞬时表达阶段细胞不健康，可能是提示有潜在的毒性。4 }) ]: i3 A+ C. h5 n  ^
顺便再说几点要注意的：
9 F9 `- I5 U* P9 d  ^1） 得到的稳定转染细胞的荧光表达量会低于瞬时转染的细胞。因为瞬时转染时，质粒进入细胞后以游离的形式存在。目的基因的表达是通过细胞的转录与翻译机制进行的。一个细胞可能‘吞入’数个质粒，因此细胞间会存在差异。总的来说，稳定转染的细胞只含有1-2个被整合的质粒。/ }( w7 J- l0 s: O
2）做G418杀伤曲线。如果筛选用的药物太浓（不同批号间的药物浓度可能不同），选择压力过强。报告基因的表达水平与筛选抗性基因的不完全正相关，细胞在过高浓度的药物中生长，报告基因的表达反而降低。过高的药物浓度也可能影响了细胞的生长状态，进而影响报告基因的表达。这些副作用在长时间的筛选过程中尤其明显。筛选后的细胞培养，建议药物浓度降低为筛选时的1/2到1/5。; s& I8 p/ T5 G2 r7 e
3）总的来说，细胞培养时间在1-2个月内表达比较稳定，因此，建议分装冻存筛选过后的细胞，然后复苏原管，以确保细胞的统一性。  ~' R! z& j) z" K! z" U& d; e

mckf111

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非常感谢 再问下筛选前细胞融合度大概要多少合适？

Chunjieliu

脂质体转染某些细胞的效率较低，可以试着改变一下，脂质体与质粒DNA的混合比例，有文章指出当脂质体/DNA为1.25时，转染效率最高，楼主不妨试一下。

qingbao

9 G9 b, F! i% p
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我看转染效率的问题大家已经在这个帖子里讨论了很多：http://www.stemcell8.cn/thread-35512-1-1.html。
  V, K' M* b; q5 Z0 S8 U6 j! k" V用阳性表达5-10%的细胞来作稳定压力筛选还是有些挑战的。建议还是要把转染的阳性表达率提高上去再做后续筛选比较合适。另外做稳定筛选的G418给药压力是要事先做梯度的。给你一个我自己总结的protocol，看是否对你有帮助。5 E/ F- |& M* q
文档 2.pdf (27.45 KB)

2011-3-8 13:43 上传

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下载积分: 威望 -2 , 包包 -5

2 s$ g, ?# S: e
本来想粘贴word的，但是表格会乱套。所以只能用附件，没有设下载包包的，不知最后是否需要你的包包。
& ~1 A# u9 g! D又试了一下，给你贴图了，这样可以不需要下载就能看。
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2011-3-8 13:48 上传

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