为什么细胞没铺匀？

mbjane

我复苏的MEF细胞，将离心重悬的细胞悬液，加至10cm的培养皿的中间，十字方向摇晃了很多次，放入培养箱。
( z4 [$ L0 \+ ~* b第二天镜下观察，细胞中间密集，其他区域较稀。且密集区域的贴壁细胞上吸附了较多死亡细胞。
# J. M) D+ }9 h  s+ Z1 T- l. R, h请教高手，怎么会出现这样的情况呢？对于培养皿，铺板均匀的关键是将悬液按需要体积吹打均匀后，s线滴加吗？" D4 |8 N* E8 G1 e

# x& J* S  l+ _# Q1 p

dxb1985

回复 mbjane 的帖子
- s  v! N1 o- z( ~% X6 r+ n
/ C$ C7 b5 {1 e0 N, ~铺板时最好不要来回晃动，要不然细胞都集中到中间了，用移液器吹打均匀即可8 y: J5 N' R- q/ H3 x) T0 u

hcluo

建议吹打均匀以后，放置2min左右，让细胞沉下来，此时不要摇动，然后就可以放回培养箱培养了，基本会均匀的。

hyde

我也刚开始学习如何养好细胞，师兄们教的也是说要十字晃动一下的，绕圈晃会因为向心力把细胞往中间聚集。吹打均匀的时候我会产生很多气泡，不知道如何处理……

jefferson

1, 重悬时要打匀, 防止存在部分细胞团, 那么铺皿后就会不均匀. 吹打时吸管头不要离开液面, 直接伸在悬液中吹打, 且每次不要将管子中的悬液全部打出, 这样就不会吹打出气泡. 0 ]  H$ X5 l) W, J$ ]( [! \

' R: L0 J% d% K6 b2. 十字混匀时幅度不要过大, 否则细胞悬液会在皿内产生小的漩涡状运动, 细胞就会聚集在中间. 4 z, T, Z; r; i

% L& h! N( B5 w) x8 @3 p3. 混匀放到培养箱内后, 也要十字向混匀一两次, 因为在拿的过程中肯定不会水平, 可能就会造成细胞的分布不均,  这点比较重要.. b# Y9 b+ y9 B7 _, G. S

hyde

回复 jefferson 的帖子: ?' g5 y: R) U, L3 B

4 S8 R- o4 U9 U/ ~试试

hyde

回复 jefferson 的帖子5 F& a/ r' W8 s7 N$ U2 ^6 t

8 Y/ I4 Q* _4 n- i7 u7 C传代后很多细胞没能贴壁死亡了，是不是因为传代时吹打太猛或者消化过度^

张也行

10cm板很容易晃匀，不用那么多下，只要保证细胞中间没有打转就行。

希望之光

呵呵 我原来也出现过这样的问题 我的具体做法是：先在培养皿低加上一毫升得培养液将底部溶湿，再在中间加上重悬的细胞，顺时针转四圈逆时针转四圈，然后前后左右各四圈，力度呢得看你怎么把握了，我一开始时会在镜子下看 知道找到合适得力度，现在铺的很匀

jefferson

hyde 发表于 2011-3-10 20:11 4 A! `% J1 T9 Z) b6 o2 D) n: V8 `
回复 jefferson 的帖子. M8 ]( s  s2 n) V$ ^; Q! t# w
, F; I4 I) Y9 J2 v0 Q! B8 P9 V
传代后很多细胞没能贴壁死亡了，是不是因为传代时吹打太猛或者消化过度^

1 O; E- r% Z; T是MEF吗?" t, l7 l& C" M+ |! @

+ P6 R- _/ W9 [0 gMEF细胞还是比较好养的, 传代死细胞多一般不会是吹打造成的, 这个细胞没那么娇贵. 消化过度是可能的原因之一, 消化时最好摸索下胰酶的作用时间和用量, 一般最好要在两分钟内用最少的胰酶消化下来. 另外需要注意的是消化后用血清培基终止后, 最好离心弃上清, 然后再重悬接种.这样可以将消化时的胰酶去除干净, 避免对细胞生长造成影响.9 ?! Y9 ^: G  W/ b# T& R
5 s8 Z* b$ p3 K& f+ N4 _$ H
另外就是需要检查下其他因素, 如培养基是否正常有效, PH值是否已有明显变化, 细胞是否存在污染, 如支原体污染等