求助：求流式细胞术鉴定细胞的具体操作步骤？

stefan

      由于要对培养的细胞进行表面抗原鉴定，要用到流式细胞术。虽然已经做了一段时间的细胞培养，但是由于以前没接触到流式细胞，对这个方面还是比较陌生，想要请教各位高手：进行流式细胞术的具体实验步骤是什么样的？如：做一次流式要用到得细胞数？做流式前要怎么处理细胞，还请高手指点？谢谢谢谢了！！

dove365cn

先了解一下流式细胞仪的原理吧,给你一分资料,你先看看
4 O  A9 \" j# V% W2 b关于需要多少细胞量, 看你测的总的抗体素了,一般鉴定都做单染, 每个抗体按1×10的6次方计算, 再乘以抗体数就是所需的总细胞量. 比如你要做5个抗体,那就需要5×10的6次方个细胞.别忘了还需做阴性对照或同型对照.
3 {4 p0 X3 t3 i5 R' ?3 ]膜表面分子的标记还是很简单的., ~: T0 N1 x; m( e9 ~+ q8 E
细胞的处理,贴壁细胞需先胰酶消化至单个细胞, 然后单细胞悬液经PBS洗涤一次, 以除去血清\培养基等到物质; 然后标记抗体,一般为4度30分钟, 然后PBS洗涤一到两次,除去未结合的抗体; 此时便可以上流式细胞仪检测了.

cjhpumc

给你发一个我们实验室的protocol供参考
$ v$ F$ [! i$ x  C0 u4 n) G流式细胞术分析干细胞表型* n. S6 b& U) v) K0 j- q8 |5 H! @0 c
1．        细胞经胰酶消化，1000rpm 10min,PBS洗2遍。
' @1 L/ k/ t4 d2．        PBS重悬细胞，分装至EP(1ul/管)，2000转 6min 离心，弃上清，拍散细胞，加1ul抗体/管(塑料小瓶包装)，10ul抗体/管（大玻璃瓶包装）。注意：加完抗体的管子要马上盖盖，避免混淆。
- B( K1 [5 N4 X& Y" s; _3．        4℃避光孵育30min,各管加1mlPBS, 2000转 6min 离心，重复2遍。
2 z" U& P4 z7 r' \4．        最后加0.5mlPBS重悬，再用滤膜过滤除去细胞团以避免堵塞流式仪。! }2 K* Z$ w& t4 ^( [0 r
注意：要求细胞数量达每管1＊105细胞，根据细胞表型的数量决定所需细胞的数量。- w/ {# X% q4 t# ~* b1 I

zxdlala

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& l) e2 f; F" I, A9 u8 u/ [' {' l* R! Z( ]6 \
你好，我想问下阴性对照和同型对照应该怎么设计呢？是不是再检测一个阴性标记？

sarah19860420

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5 M' Z5 k+ x8 j. I9 j7 o& o% y) ~) b6 n% m4 @& o! R) ]" E3 k! ^
您好，我想确认下您的意思是每种细胞每种抗体需要的细胞数是10*5，对吗。我看BD的protocol上说的是每种抗体需要的是10*6，到底哪个对呢。您帮忙看下，谢谢。

sarah19860420

回复 dove365cn 的帖子- {! X2 S" b- q2 v" Z, I

3 b0 h( V6 q; T# F4 M! K* ^% I您好，我想确认下您的意思是每种细胞每种抗体需要的细胞数是10*6，对吗。但是楼下的又说是1*105，到底哪个对呢。实话说细胞确实也不多，而且需要做的抗体数是9个加上1个阴性对照，如果按照您说的细胞数目需要10*7个细胞了。请帮我确认下，谢谢

mengnancy

一个检测管，需要1*10^6个细胞，可以做双染或者三染，可以节省细胞。

zhangy259

请问 抗体 在哪家买 会好些？

123jiaoyue

回复 zhangy259 的帖子! i1 m! j% h7 G7 E6 B5 S( F; V& [# k

5 J1 C. |4 Q7 I+ pBD公司有做干细胞鉴定的试剂盒，效果不错 就是价格有点高 & x4 L9 U6 ^7 E( B: P
BD的抗体 abcam 的抗体都还不错 进口的抗体浓度高一些，国产的就不一定的

123jiaoyue

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; [7 E  N% O. R1 B- @8 S4 I  f/ |/ |0 ^9 I6 d
我想知道设门怎么设啊
0 b. I% e0 b) w) W- j( ~设不好 峰也有问题