求助：求流式细胞术鉴定细胞的具体操作步骤？

stefan

      由于要对培养的细胞进行表面抗原鉴定，要用到流式细胞术。虽然已经做了一段时间的细胞培养，但是由于以前没接触到流式细胞，对这个方面还是比较陌生，想要请教各位高手：进行流式细胞术的具体实验步骤是什么样的？如：做一次流式要用到得细胞数？做流式前要怎么处理细胞，还请高手指点？谢谢谢谢了！！

dove365cn

先了解一下流式细胞仪的原理吧,给你一分资料,你先看看
; k. M6 q. ~1 G6 g' x5 U9 N关于需要多少细胞量, 看你测的总的抗体素了,一般鉴定都做单染, 每个抗体按1×10的6次方计算, 再乘以抗体数就是所需的总细胞量. 比如你要做5个抗体,那就需要5×10的6次方个细胞.别忘了还需做阴性对照或同型对照.2 Z* a$ Z, y; q+ t2 @
膜表面分子的标记还是很简单的.$ ?! b4 D8 x9 ^8 [  [+ ~; T: X
细胞的处理,贴壁细胞需先胰酶消化至单个细胞, 然后单细胞悬液经PBS洗涤一次, 以除去血清\培养基等到物质; 然后标记抗体,一般为4度30分钟, 然后PBS洗涤一到两次,除去未结合的抗体; 此时便可以上流式细胞仪检测了.

cjhpumc

给你发一个我们实验室的protocol供参考
, h3 K2 o, H1 f  K1 M9 |) n9 c流式细胞术分析干细胞表型
1 X5 O6 ?4 \$ M# c: O. W1．        细胞经胰酶消化，1000rpm 10min,PBS洗2遍。" \. }+ a+ d2 a% X4 f
2．        PBS重悬细胞，分装至EP(1ul/管)，2000转 6min 离心，弃上清，拍散细胞，加1ul抗体/管(塑料小瓶包装)，10ul抗体/管（大玻璃瓶包装）。注意：加完抗体的管子要马上盖盖，避免混淆。* m3 Z# g9 ~+ U1 c
3．        4℃避光孵育30min,各管加1mlPBS, 2000转 6min 离心，重复2遍。. `! V4 |! z; A4 L2 e) l% {- @" I
4．        最后加0.5mlPBS重悬，再用滤膜过滤除去细胞团以避免堵塞流式仪。
4 B* f* Q( j) `0 ]1 K; e注意：要求细胞数量达每管1＊105细胞，根据细胞表型的数量决定所需细胞的数量。  k4 _/ X$ B& m) F1 K; p' [

zxdlala

回复 dove365cn 的帖子
3 {0 N3 ^0 A& _% E5 @# I$ H5 s  ?5 b/ u
你好，我想问下阴性对照和同型对照应该怎么设计呢？是不是再检测一个阴性标记？

sarah19860420

回复 cjhpumc 的帖子
2 j4 E. M6 H2 z* e& S5 c
, K; \3 n/ J" I. C9 ?+ ]) e% p您好，我想确认下您的意思是每种细胞每种抗体需要的细胞数是10*5，对吗。我看BD的protocol上说的是每种抗体需要的是10*6，到底哪个对呢。您帮忙看下，谢谢。

sarah19860420

回复 dove365cn 的帖子
. _4 e0 p% y8 Y7 ~! f  e
! R) D/ k  S- C( |) j' L您好，我想确认下您的意思是每种细胞每种抗体需要的细胞数是10*6，对吗。但是楼下的又说是1*105，到底哪个对呢。实话说细胞确实也不多，而且需要做的抗体数是9个加上1个阴性对照，如果按照您说的细胞数目需要10*7个细胞了。请帮我确认下，谢谢

mengnancy

一个检测管，需要1*10^6个细胞，可以做双染或者三染，可以节省细胞。

zhangy259

请问 抗体 在哪家买 会好些？

123jiaoyue

回复 zhangy259 的帖子  f9 l( o* r' @( k9 \! L8 ?

" {7 ]2 y. k) L8 v4 i1 MBD公司有做干细胞鉴定的试剂盒，效果不错 就是价格有点高 5 n7 v  I7 @8 M6 [% e8 h) m# y
BD的抗体 abcam 的抗体都还不错 进口的抗体浓度高一些，国产的就不一定的

123jiaoyue

回复 mengnancy 的帖子
; l  P; I& R- J, V. y; U4 X  \" h2 T2 T$ U
我想知道设门怎么设啊
! M- M" Q, G* t5 v设不好 峰也有问题