求助：求流式细胞术鉴定细胞的具体操作步骤？

stefan

      由于要对培养的细胞进行表面抗原鉴定，要用到流式细胞术。虽然已经做了一段时间的细胞培养，但是由于以前没接触到流式细胞，对这个方面还是比较陌生，想要请教各位高手：进行流式细胞术的具体实验步骤是什么样的？如：做一次流式要用到得细胞数？做流式前要怎么处理细胞，还请高手指点？谢谢谢谢了！！

dove365cn

先了解一下流式细胞仪的原理吧,给你一分资料,你先看看$ p" z& z8 U- m9 i* H0 X- N5 h+ R
关于需要多少细胞量, 看你测的总的抗体素了,一般鉴定都做单染, 每个抗体按1×10的6次方计算, 再乘以抗体数就是所需的总细胞量. 比如你要做5个抗体,那就需要5×10的6次方个细胞.别忘了还需做阴性对照或同型对照.
# V- i2 Q' W9 Q膜表面分子的标记还是很简单的.
  O# N, b: J: d0 }细胞的处理,贴壁细胞需先胰酶消化至单个细胞, 然后单细胞悬液经PBS洗涤一次, 以除去血清\培养基等到物质; 然后标记抗体,一般为4度30分钟, 然后PBS洗涤一到两次,除去未结合的抗体; 此时便可以上流式细胞仪检测了.

cjhpumc

给你发一个我们实验室的protocol供参考* l0 ~; y7 p; o) B1 e
流式细胞术分析干细胞表型
0 u! j  @3 d2 L  ]4 g2 j5 K1．        细胞经胰酶消化，1000rpm 10min,PBS洗2遍。0 Q& s' i% R: s6 C0 O
2．        PBS重悬细胞，分装至EP(1ul/管)，2000转 6min 离心，弃上清，拍散细胞，加1ul抗体/管(塑料小瓶包装)，10ul抗体/管（大玻璃瓶包装）。注意：加完抗体的管子要马上盖盖，避免混淆。
; m; D0 E9 U" N4 W! S/ p3．        4℃避光孵育30min,各管加1mlPBS, 2000转 6min 离心，重复2遍。- v1 j0 V. G3 P1 P2 n3 @) S9 i
4．        最后加0.5mlPBS重悬，再用滤膜过滤除去细胞团以避免堵塞流式仪。- C0 p+ Z" f9 N1 w0 N! Z
注意：要求细胞数量达每管1＊105细胞，根据细胞表型的数量决定所需细胞的数量。: p: M! q% E' O8 H* \

zxdlala

回复 dove365cn 的帖子7 y( Q' m2 @1 b: n' z
  Z0 e- g& G# @6 f$ v& k
你好，我想问下阴性对照和同型对照应该怎么设计呢？是不是再检测一个阴性标记？

sarah19860420

回复 cjhpumc 的帖子$ N& j6 b6 r9 [
) W9 \# a) `( y* j5 g6 `' J) _
您好，我想确认下您的意思是每种细胞每种抗体需要的细胞数是10*5，对吗。我看BD的protocol上说的是每种抗体需要的是10*6，到底哪个对呢。您帮忙看下，谢谢。

sarah19860420

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& I( f; I% `0 S; n/ C6 p2 R3 B* C0 B( N# t. r7 i
您好，我想确认下您的意思是每种细胞每种抗体需要的细胞数是10*6，对吗。但是楼下的又说是1*105，到底哪个对呢。实话说细胞确实也不多，而且需要做的抗体数是9个加上1个阴性对照，如果按照您说的细胞数目需要10*7个细胞了。请帮我确认下，谢谢

mengnancy

一个检测管，需要1*10^6个细胞，可以做双染或者三染，可以节省细胞。

zhangy259

请问 抗体 在哪家买 会好些？

123jiaoyue

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5 f. t, j, i2 F# ~6 `* o
1 y/ j! w. @$ r5 mBD公司有做干细胞鉴定的试剂盒，效果不错 就是价格有点高
3 [6 N8 T: e" rBD的抗体 abcam 的抗体都还不错 进口的抗体浓度高一些，国产的就不一定的

123jiaoyue

回复 mengnancy 的帖子3 v* S9 s( w( I
- O! m. t7 c6 t9 q# t: |
我想知道设门怎么设啊 . Q: \5 J, e! I, P" T* B
设不好 峰也有问题