求助miRNA筛选方法

myjnqr

请教高人：做完芯片后，面对很多差异表达的miRNA，如何筛选目标miRNA？

myjnqr

回复 深海寂寞鱼 的帖子2 k5 _5 c- n6 p$ h' K
: e7 C7 m8 [- V6 d; @" e
深海寂寞鱼：
% j$ E) d0 u, j/ \5 s    请问用染料法能区别开高度同源的miRNA 吗？那些后面有abcd的miRNA比如let7 miRNA20a和20b？

myjnqr

深海寂寞鱼：
  S) ]8 ]7 S2 B) q    很感谢您的帮助，祝愿您在实验中或事业上顺顺利利！

深海寂寞鱼

回复 myjnqr 的帖子. X" E7 B- Y. b* A- {
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to myjnqr：
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    我觉得差异的倍数大，比单纯的绝对值高，有意义的多。
9 D$ Z: {6 k# T2 ?% H: t7 j9 r- E& b. H
    原因是，绝对值受到的影响因素相对较多，比如  细胞本身的表达丰度，芯片探针的结合效率，荧光素活性等等。所以不同miRNA之间绝对值的大小可以参考，但是不能作为依据。
  k8 g: }+ P7 o+ {% E0 n* A
! i& ]1 A1 H; s) J( [: `6 M0 j    与之相反，同一miRNA之间的绝对值之间的差异是具有可比性的。因为结合效率、荧光活性等影响因素都是同等的。所以差异最大的可能性来自于miRNA表达量的差异。" I; h) ]' m; N7 h$ e

6 b  H" B8 d/ S! I7 I5 w     希望这点上我解释清楚了。
: ^6 }7 q! d7 U( J3 E7 _) k) Q5 Z6 d- F7 s7 k, `& y6 @
     至于后续的实验是选“已知与干细胞相关的miRNA”还是选“不在已知干细胞相关miRNA之列的miRNA”，我觉得这没有绝对。大概的利弊是这样的。! O: j; H$ m) d1 K/ l- I0 q9 [

  k/ Q4 h- j3 p* a     在你目前样品和数据绝对可靠的前提下，0 j/ g8 G1 ?* H, W
% f6 |% p( c$ J, Z
     如果你选择“已知与干细胞相关的miRNA”，那么你后续的实验风险相对较低，遇到困难可供参考的文献和经验也多。但是发文章的时“创新性”会降低。同样的工作量和实验费用，换得的文章影响因子会降低。5 i  Q* |0 M% f7 b

: C8 x6 |1 g% O$ }# u- B     相反，如果你选择“不在已知之列的miRNA”，那么后续实验风险大，或许你用real－time一重复，根本就得不到芯片的结果（芯片的结果可能是一次偶然时间）。如果能用real－time 重复出结果，接着往后面走，有些东西，比如miRNA靶基因的预测与验证，也需要有个自己筛选的过程。但是一旦你能成功，那么文章的创新性可能会高，投稿容易让reviewer感兴趣。后面就是相对好一些的影响因子。
3 ]) ?3 l! F7 E, W
+ K2 f3 N0 }$ o      但是风险和收益需要你根据自己的实际情况考虑。
1 j' l) U# J4 k
4 D5 X4 o2 a4 D8 ?7 U& B- ?      折中的选择：在你不缺实验经费，又愿意自己付出更多的努力的话，那么你就分别从两类中各选几个miRNA往后做，根据实验结果逐步放下一些，选择一些继续往深入做。这样就是费时费力但是相对降低了风险。. d- z! [3 ]7 @3 @
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9 l- X3 D+ ?: a0 k9 \* G: e* T
      唠唠叨叨了那么多，希望能对你有所帮助。
4 U  r# ?/ ~( n) R9 t1 }
7 z7 b& G2 n5 Z- `' ?6 \      祝实验顺利。

myjnqr

很受益，谢谢啦！我样本里有关干细胞的miRNA信号值虽然低 但是差异倍数很大，这该如何考虑？和不在已知干细胞列但信号值高并且差异倍数大的miRNA 这两部分优先考虑那些？

深海寂寞鱼

回复 myjnqr 的帖子  R6 p- }3 @$ X# k; J9 p! i* q

2 }( D+ e1 P5 {. z- B1 \to myjnqr兄弟：8 f2 ?6 y. w# N# o
6 @! ]/ x' y9 K1 w, S
    我觉得从一下几个方面着手考虑：5 A; K" c- e4 D! a1 M
% S  N' F" l( N; t( B. b) S0 H3 G
    1. 你的样品绝对是干细胞的概率有多高？你是否有功能上的证据？
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/ Y, p( R3 t* W$ ?+ J        有时候样品本身可能存在纯度不够，或者已经分化等问题。
+ \8 Y! m" ]2 ^
7 m5 L) @( }7 T       （因为毕竟一些已知的干性相关miRNA在你的样品中确实表达较低）
5 M  Y: i# b, _0 w  ^$ ]- ^
& d( E5 Z' |% G$ q* i- d0 N5 P     2. 你做芯片时，是几个样品？或者一个样品是几个重复？
! N" J/ I( ~5 f+ M& e/ L8 ]
: N* o+ d! i/ Z& O8 U# t6 P5 x         芯片数据本身也是会有误差的（当然，任何实验都会有）
, m  V" o  P7 D* I. _& o2 t1 v
% z2 z( P0 d! y* W  K  E8 R         这个决定了你所获数据的可靠程度。但是为此要付出很高的成本。
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     3. 你所说的“差异倍数大的miRNA没在已知的干细胞有关的miRNA中”* Y% [( \6 c* o7 N
$ X' f9 C9 g. J3 }: b7 M
         那么就你的知识背景，这些差异倍数大的miRNA在干细胞中有没有研究？
# s" P1 ]: v9 Z) j! k
, b1 o2 {6 g+ Z/ H         它们中有没有抑制自我更新、促进分化的miRNA？
# }+ Z' L* l/ j7 h0 g
3 e; f7 ^' U% k2 K1 E/ g         如果它们之中没有已知抑制自我更新、促进分化的miRNA（或者在分化时会上调表达的miRNA），那么就可以主观推断你可能有新的发现。接下来就是用Real－time PCR去验证你感兴趣的几个差异大的miRNA。然后进行功能研究（上调、下调，靶点预测、验证，生物学功能检测）等等。% A, Q3 H. Q9 r- w

( G2 v' w; u; K) J: S         如果它们之中确实有已知的抑制自我更新、促进分化的miRNA（或者在分化时会上调表达的miRNA），那么我们可能得回到第一个问题。你送样时你的样品干细胞的比例或者纯度如何？, b) j8 M0 x) R& x1 v

$ _; M" B8 y7 `' C4 Q8 b7 Z9 Y8 R        这些只是我个人的一些想法，未必正确。
+ [3 X7 C2 N% b1 V- Q$ [) @$ T7 X' j0 |- D( N+ z( B4 x3 w
        欢迎多多交流，擦出火花。
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. {5 H# D( j+ \7 X  I2 L0 n         

myjnqr

谢谢高人指点。我现在遇到一个问题：目前已知和干细胞有关的miRNA中 在我们的样本中信号值低于2000，不是很高；而在我们样本中信号值高，差异倍数大的miRNA没在已知和干细胞有关的miRNA中（这可能是因为我们用的是最新的miRNA芯片），这种情况我应该根据差异大的选还是根据和干细胞相关的选，望您给指点一下。谢谢！

64627675

昨天刚学到的，大致说一下，如有不妥之处望高手们莫笑，流程如下，把你认为可能有效的miRNA序列构建到一个载体上（重点就在于这个载体），用该载体转目的细胞，后加入一种药物，如果有作用则被转染的细胞能继续存活，如果没有作用细胞就会死掉，不知道我有没有说反掉，不过原理就是这样的，之所以能够这样，是因为这个载体的除了带GFP以外，还携带了一个毒性基因，这样就很容易判断这个miRNA是否有研究的价值，具体情况我改天有空再研究一下

深海寂寞鱼

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2 p9 t7 X7 }: O0 b! H8 [* Y. p3 w- H4 a
to myjnqr：% C3 H1 a! D/ S: K8 n+ f

5 x( M4 P) ]# c- h    看你时关心上调的miRNA还是关心下调的miRNA ？
4 K. b  b. O4 T* e# H* g2 G3 H7 Z4 ?0 ]1 t# K# ~
    然后选择几个差别相对较大的miRNA，用real－time PCR进行验证。
; Y. ]: U: B5 w. e. b7 b6 B
7 ^' b1 ?% l3 Y; b- s0 c$ O# h* K    下来再根据real－time PCR的结果选择差别较大的miRNA作为你的目标miRNA，进行功能验证。) j* F, m* h3 d0 F
: u) d8 w) q/ w& `- j" P
    这只是一个粗略的框架。+ K; ]# {4 W/ D8 v9 n6 S

  G* j& s6 \; D) f# O( g    你多看看文献就明白了。
$ ?" M( q9 g2 r1 h9 ?6 E4 o+ E6 X! L: a( ^4 T6 X; h. \( o' f- d
    欢迎继续交流。