求助miRNA筛选方法

myjnqr

请教高人：做完芯片后，面对很多差异表达的miRNA，如何筛选目标miRNA？

深海寂寞鱼

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& U/ y4 _: r: R9 \! D1 L' _
/ H9 [2 G# E* o$ }to myjnqr：
7 O8 x7 C! G, |: m
' @2 j- p: e. q  g* I1 y    看你时关心上调的miRNA还是关心下调的miRNA ？
3 K7 h8 w, q- v$ m1 f% ^9 r9 Y: n/ H# r/ ]/ i( V& D& C6 j  d  ~( C
    然后选择几个差别相对较大的miRNA，用real－time PCR进行验证。" P7 ^# C- D, ^. |9 X: a
0 C% k' ?% T" a: \. _( j( a$ U& u
    下来再根据real－time PCR的结果选择差别较大的miRNA作为你的目标miRNA，进行功能验证。
. o: i5 K0 q  l- w' K! W6 Z% r5 d* ?( T8 H" _8 E
    这只是一个粗略的框架。9 Z* {' u# I, t: k
3 [& W9 ], s4 B3 K+ ?, V. u
    你多看看文献就明白了。
* I  N8 t9 v2 b6 @% l( s( m+ c2 i% `, ?" x
    欢迎继续交流。

64627675

昨天刚学到的，大致说一下，如有不妥之处望高手们莫笑，流程如下，把你认为可能有效的miRNA序列构建到一个载体上（重点就在于这个载体），用该载体转目的细胞，后加入一种药物，如果有作用则被转染的细胞能继续存活，如果没有作用细胞就会死掉，不知道我有没有说反掉，不过原理就是这样的，之所以能够这样，是因为这个载体的除了带GFP以外，还携带了一个毒性基因，这样就很容易判断这个miRNA是否有研究的价值，具体情况我改天有空再研究一下

myjnqr

谢谢高人指点。我现在遇到一个问题：目前已知和干细胞有关的miRNA中 在我们的样本中信号值低于2000，不是很高；而在我们样本中信号值高，差异倍数大的miRNA没在已知和干细胞有关的miRNA中（这可能是因为我们用的是最新的miRNA芯片），这种情况我应该根据差异大的选还是根据和干细胞相关的选，望您给指点一下。谢谢！

深海寂寞鱼

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' g3 N$ v+ V7 d; B9 h* S
6 O, G" y7 ]$ n' O& {! D1 i& i  Vto myjnqr兄弟：
: y% W5 u4 ?7 e0 O/ H$ G7 u. I6 N9 k6 v: e; ^$ `
    我觉得从一下几个方面着手考虑：# ?- J3 z! X9 I

3 v7 t! X7 d6 N    1. 你的样品绝对是干细胞的概率有多高？你是否有功能上的证据？
8 g2 H) Z' P# r0 P% E7 Q* E' O. c+ }4 A) H) a$ G, N8 C
        有时候样品本身可能存在纯度不够，或者已经分化等问题。
3 w% W2 O: h& s. D) M+ B  D# d3 W# v6 ^( h* n3 `
       （因为毕竟一些已知的干性相关miRNA在你的样品中确实表达较低）# P' v5 x6 c8 }( z4 g

- D3 c. L$ A6 c  o  W     2. 你做芯片时，是几个样品？或者一个样品是几个重复？
7 z* ^! v/ E. Z4 [- _$ @- j" b$ `1 k0 j" G. D( k" U
         芯片数据本身也是会有误差的（当然，任何实验都会有）  q' V, `* X; d0 u" j$ [$ G6 ]0 O& B
, M/ H7 n6 U  V) }- D
         这个决定了你所获数据的可靠程度。但是为此要付出很高的成本。5 N& a' Q1 z  E( n

2 P; U) q$ ?8 ?5 j1 S     3. 你所说的“差异倍数大的miRNA没在已知的干细胞有关的miRNA中”
4 g& [& x2 D! a, o! H3 ^8 o6 W0 Y5 O: U1 e. s; {
         那么就你的知识背景，这些差异倍数大的miRNA在干细胞中有没有研究？
/ @( C% Z' K  J( w0 T
) b1 D; z. M; P5 U2 v         它们中有没有抑制自我更新、促进分化的miRNA？, Z2 {; u9 c3 g. {. R
# z8 k$ \, V5 J' J! L
         如果它们之中没有已知抑制自我更新、促进分化的miRNA（或者在分化时会上调表达的miRNA），那么就可以主观推断你可能有新的发现。接下来就是用Real－time PCR去验证你感兴趣的几个差异大的miRNA。然后进行功能研究（上调、下调，靶点预测、验证，生物学功能检测）等等。/ Q* S" q1 T& ]! }( B. l' o" K

5 N% o! z) X" J; a         如果它们之中确实有已知的抑制自我更新、促进分化的miRNA（或者在分化时会上调表达的miRNA），那么我们可能得回到第一个问题。你送样时你的样品干细胞的比例或者纯度如何？
- U+ k& o- _" Y( n, R7 n0 M
0 |" M6 l0 Z, ^! x" z        这些只是我个人的一些想法，未必正确。
+ z; h# }% L" }9 K/ o) g, a8 ^* G+ c7 Z' b0 d
        欢迎多多交流，擦出火花。
* ^& V+ G: q2 d; ]3 L' I& N6 ^# {+ _# N& C4 i3 @- S
         

myjnqr

很受益，谢谢啦！我样本里有关干细胞的miRNA信号值虽然低 但是差异倍数很大，这该如何考虑？和不在已知干细胞列但信号值高并且差异倍数大的miRNA 这两部分优先考虑那些？

深海寂寞鱼

回复 myjnqr 的帖子$ n" i0 [- N/ e) ~) `/ B2 \* Y- Q1 v" L
6 M0 I: q+ X3 y6 u1 B5 \. \6 g
to myjnqr：4 q- J. ~* _7 e3 B. V# w; ]
' o/ ]  m8 Z0 l8 C7 h. w
    我觉得差异的倍数大，比单纯的绝对值高，有意义的多。3 o2 H7 b# O) ~' t+ A  H8 m
. `. R; S  x6 U
    原因是，绝对值受到的影响因素相对较多，比如  细胞本身的表达丰度，芯片探针的结合效率，荧光素活性等等。所以不同miRNA之间绝对值的大小可以参考，但是不能作为依据。  u( S+ f2 ^. X) U

3 I2 @/ }# Y% s5 _+ R) d    与之相反，同一miRNA之间的绝对值之间的差异是具有可比性的。因为结合效率、荧光活性等影响因素都是同等的。所以差异最大的可能性来自于miRNA表达量的差异。3 ~  a$ @5 I- ?1 p' K2 T
& h4 b9 I2 W8 b
     希望这点上我解释清楚了。
$ C: t% p( B" U& k% @2 u* C0 m0 n
     至于后续的实验是选“已知与干细胞相关的miRNA”还是选“不在已知干细胞相关miRNA之列的miRNA”，我觉得这没有绝对。大概的利弊是这样的。- |+ D* _+ K, A' [) r

) s0 a" g8 g! K7 B3 S     在你目前样品和数据绝对可靠的前提下，
( K/ q: g5 ]2 X& M8 z0 k1 |  N6 A+ {8 g
     如果你选择“已知与干细胞相关的miRNA”，那么你后续的实验风险相对较低，遇到困难可供参考的文献和经验也多。但是发文章的时“创新性”会降低。同样的工作量和实验费用，换得的文章影响因子会降低。! D7 n1 k4 d8 H: j7 Q+ a; ]
& F% ~" a5 g2 A+ ~" F7 m: ?
     相反，如果你选择“不在已知之列的miRNA”，那么后续实验风险大，或许你用real－time一重复，根本就得不到芯片的结果（芯片的结果可能是一次偶然时间）。如果能用real－time 重复出结果，接着往后面走，有些东西，比如miRNA靶基因的预测与验证，也需要有个自己筛选的过程。但是一旦你能成功，那么文章的创新性可能会高，投稿容易让reviewer感兴趣。后面就是相对好一些的影响因子。
4 q, Z, l. V3 W) ]3 T9 u' A8 K2 a4 N$ t+ X7 K# P
      但是风险和收益需要你根据自己的实际情况考虑。
  H& i, N4 H  C' P: `1 ~5 G, @
" p. T4 K6 O+ }8 ~# F$ g8 o      折中的选择：在你不缺实验经费，又愿意自己付出更多的努力的话，那么你就分别从两类中各选几个miRNA往后做，根据实验结果逐步放下一些，选择一些继续往深入做。这样就是费时费力但是相对降低了风险。
# B! l/ M7 ?" j* U4 n6 |8 i! T/ m5 ]

! @: F5 ?% c# ?$ x: t7 K- q) O      唠唠叨叨了那么多，希望能对你有所帮助。
% o  Q1 g6 K) m' w2 M8 o" N) [4 F' q2 e
      祝实验顺利。

myjnqr

深海寂寞鱼：
$ d  A5 K8 ?3 |& v    很感谢您的帮助，祝愿您在实验中或事业上顺顺利利！

myjnqr

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深海寂寞鱼：! ?5 j: s# Z) W: W# ^# [
    请问用染料法能区别开高度同源的miRNA 吗？那些后面有abcd的miRNA比如let7 miRNA20a和20b？