求助miRNA筛选方法

myjnqr

请教高人：做完芯片后，面对很多差异表达的miRNA，如何筛选目标miRNA？

myjnqr

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1 H( y1 m: O0 S: P+ P5 r深海寂寞鱼：9 x" O. s* _7 o/ F# p4 r" \2 u
    请问用染料法能区别开高度同源的miRNA 吗？那些后面有abcd的miRNA比如let7 miRNA20a和20b？

myjnqr

深海寂寞鱼：% C0 I" N9 G' Z7 e7 R5 G8 f
    很感谢您的帮助，祝愿您在实验中或事业上顺顺利利！

深海寂寞鱼

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2 d' u  B4 H6 T" ?to myjnqr：
/ t4 L/ t9 M, `; A' k- L
8 _# p6 o# L; N5 `6 B, d    我觉得差异的倍数大，比单纯的绝对值高，有意义的多。  @1 ?( g. o% ]3 I1 Q

3 H/ g# @; r: [+ U, D" K: q    原因是，绝对值受到的影响因素相对较多，比如  细胞本身的表达丰度，芯片探针的结合效率，荧光素活性等等。所以不同miRNA之间绝对值的大小可以参考，但是不能作为依据。9 x% K' A( Z; t& W: _
- r4 _* K1 X5 J, a0 W! m
    与之相反，同一miRNA之间的绝对值之间的差异是具有可比性的。因为结合效率、荧光活性等影响因素都是同等的。所以差异最大的可能性来自于miRNA表达量的差异。
! t  m' f; y: t6 l7 W7 V0 l
3 s8 P/ b+ m, @% S     希望这点上我解释清楚了。6 q" y1 M5 H; N
. c: O3 y9 n/ q. p2 Q
     至于后续的实验是选“已知与干细胞相关的miRNA”还是选“不在已知干细胞相关miRNA之列的miRNA”，我觉得这没有绝对。大概的利弊是这样的。
$ J2 c- D$ j: P0 N& ~  M# w
& H1 G( ?6 O' b4 E/ v1 z     在你目前样品和数据绝对可靠的前提下，; g. N& y7 J" ^5 t; g2 U

: `( P! W; k+ A5 L  Z; \/ K# n6 z     如果你选择“已知与干细胞相关的miRNA”，那么你后续的实验风险相对较低，遇到困难可供参考的文献和经验也多。但是发文章的时“创新性”会降低。同样的工作量和实验费用，换得的文章影响因子会降低。8 z8 N8 R# T/ O. }  x1 T
+ d' s' @2 L$ {; g
     相反，如果你选择“不在已知之列的miRNA”，那么后续实验风险大，或许你用real－time一重复，根本就得不到芯片的结果（芯片的结果可能是一次偶然时间）。如果能用real－time 重复出结果，接着往后面走，有些东西，比如miRNA靶基因的预测与验证，也需要有个自己筛选的过程。但是一旦你能成功，那么文章的创新性可能会高，投稿容易让reviewer感兴趣。后面就是相对好一些的影响因子。
7 J, x7 T2 C4 {: `# l. p3 n7 N1 X5 e$ s7 |
      但是风险和收益需要你根据自己的实际情况考虑。  c7 c+ q  b* d  Z4 T' w

4 x4 X; |, N: S8 m9 |      折中的选择：在你不缺实验经费，又愿意自己付出更多的努力的话，那么你就分别从两类中各选几个miRNA往后做，根据实验结果逐步放下一些，选择一些继续往深入做。这样就是费时费力但是相对降低了风险。
( W) k: P4 O' }8 a! r! P
$ B( m% q. P: m1 R  [) o/ d" N) v& e6 [" J' l3 L
      唠唠叨叨了那么多，希望能对你有所帮助。
7 W# v- g, S! `+ J% m
* Q% z3 P+ O: P  S, S      祝实验顺利。

myjnqr

很受益，谢谢啦！我样本里有关干细胞的miRNA信号值虽然低 但是差异倍数很大，这该如何考虑？和不在已知干细胞列但信号值高并且差异倍数大的miRNA 这两部分优先考虑那些？

深海寂寞鱼

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' e0 i) ]5 M: Q) {* E
to myjnqr兄弟：
  R6 v) ^: I- a* B" B+ e& Z0 B7 c# e% H
    我觉得从一下几个方面着手考虑：
6 v  X* Y. b1 \1 M6 a' R
' P$ q( k! Y& ?& p- Q7 M8 k5 i    1. 你的样品绝对是干细胞的概率有多高？你是否有功能上的证据？9 |3 C/ J. J8 \! a' Z% C1 q2 l5 w

5 G' t/ N' p% @" h% _        有时候样品本身可能存在纯度不够，或者已经分化等问题。
6 A1 x/ s" G5 Y* R4 E
7 Z1 `8 \% O* G4 f+ V       （因为毕竟一些已知的干性相关miRNA在你的样品中确实表达较低）& I& Y- i% M1 R- v+ H1 N

8 M6 {) @8 d) v; ^     2. 你做芯片时，是几个样品？或者一个样品是几个重复？. \4 |5 M; I& ?( Q

. B7 \# M, N* \& K8 f         芯片数据本身也是会有误差的（当然，任何实验都会有）
3 r& s  j2 l! }, [3 t+ o' o' K# u/ J. v7 O1 d
         这个决定了你所获数据的可靠程度。但是为此要付出很高的成本。
" S( _+ G) T# V' x8 e
. F# k* ^' p; o+ }) n     3. 你所说的“差异倍数大的miRNA没在已知的干细胞有关的miRNA中”; W/ ?& D  o9 K! c+ a
& Y3 X$ q. W+ q$ ]2 _  \2 \/ h+ ~
         那么就你的知识背景，这些差异倍数大的miRNA在干细胞中有没有研究？
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& Z: y" t& i$ N5 B         它们中有没有抑制自我更新、促进分化的miRNA？
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         如果它们之中没有已知抑制自我更新、促进分化的miRNA（或者在分化时会上调表达的miRNA），那么就可以主观推断你可能有新的发现。接下来就是用Real－time PCR去验证你感兴趣的几个差异大的miRNA。然后进行功能研究（上调、下调，靶点预测、验证，生物学功能检测）等等。
: e6 Q% b. t' f, w) O$ j' A% _: L4 S$ D6 z  ]6 |& ?; s
         如果它们之中确实有已知的抑制自我更新、促进分化的miRNA（或者在分化时会上调表达的miRNA），那么我们可能得回到第一个问题。你送样时你的样品干细胞的比例或者纯度如何？2 U  [  a2 v1 ~
' Y4 L4 ]! v# ?. u
        这些只是我个人的一些想法，未必正确。
( Q# H; R& K- m' U6 Q
7 R% y/ h. \$ d! ?# w        欢迎多多交流，擦出火花。0 L! H1 G2 t( V4 S4 K5 X

( @$ Q  D& ~2 F$ ~3 T9 i1 V  E         

myjnqr

谢谢高人指点。我现在遇到一个问题：目前已知和干细胞有关的miRNA中 在我们的样本中信号值低于2000，不是很高；而在我们样本中信号值高，差异倍数大的miRNA没在已知和干细胞有关的miRNA中（这可能是因为我们用的是最新的miRNA芯片），这种情况我应该根据差异大的选还是根据和干细胞相关的选，望您给指点一下。谢谢！

64627675

昨天刚学到的，大致说一下，如有不妥之处望高手们莫笑，流程如下，把你认为可能有效的miRNA序列构建到一个载体上（重点就在于这个载体），用该载体转目的细胞，后加入一种药物，如果有作用则被转染的细胞能继续存活，如果没有作用细胞就会死掉，不知道我有没有说反掉，不过原理就是这样的，之所以能够这样，是因为这个载体的除了带GFP以外，还携带了一个毒性基因，这样就很容易判断这个miRNA是否有研究的价值，具体情况我改天有空再研究一下

深海寂寞鱼

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to myjnqr：% v3 \5 l0 f" q- B7 y% k' Q! L% |
9 z2 ?% C5 A. s: f
    看你时关心上调的miRNA还是关心下调的miRNA ？/ k3 O) N4 `8 v7 h6 Q. g2 S$ A0 B8 H
- F" s; D6 a& k6 d
    然后选择几个差别相对较大的miRNA，用real－time PCR进行验证。
5 y/ F+ q- G- Y$ L  L( l+ C: x! C/ h* y' U+ Z( M9 X, y4 E
    下来再根据real－time PCR的结果选择差别较大的miRNA作为你的目标miRNA，进行功能验证。
. k1 a9 k7 J/ r+ z( w  b# n  t' h2 n4 m( ]& B6 ]6 q
    这只是一个粗略的框架。% b( I& S$ I' y$ n8 z$ `4 h
( x3 f- D. {  E) \6 S; Z( A
    你多看看文献就明白了。
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: w7 ]8 U) O, D' s; D; P    欢迎继续交流。