求助miRNA筛选方法

myjnqr

请教高人：做完芯片后，面对很多差异表达的miRNA，如何筛选目标miRNA？

深海寂寞鱼

回复 myjnqr 的帖子3 V. s0 ]2 g6 N6 x% V8 h' t6 m8 [1 r- Q

* r8 T- K6 [5 d8 ?( xto myjnqr：' A: r6 ^. L: g1 u1 @6 \  Z
& u( u8 ~1 A0 T6 Y
    看你时关心上调的miRNA还是关心下调的miRNA ？
; g: b9 [- Y8 x3 d5 S5 b3 }. I& G& m" ^! n+ L
    然后选择几个差别相对较大的miRNA，用real－time PCR进行验证。
; R! f7 e5 C4 ~# S: H5 H2 |9 R4 G+ I- q
    下来再根据real－time PCR的结果选择差别较大的miRNA作为你的目标miRNA，进行功能验证。0 I* U0 t, _# e- s$ l
4 \1 }8 T' N" u
    这只是一个粗略的框架。
' ?5 t  w5 ^; s, y8 c/ K8 A
9 ^- G# }5 M2 u3 S    你多看看文献就明白了。
1 r" s5 w2 m/ w7 o7 a  }7 S. ^$ w" o) F7 p) E" b, v6 G
    欢迎继续交流。

64627675

昨天刚学到的，大致说一下，如有不妥之处望高手们莫笑，流程如下，把你认为可能有效的miRNA序列构建到一个载体上（重点就在于这个载体），用该载体转目的细胞，后加入一种药物，如果有作用则被转染的细胞能继续存活，如果没有作用细胞就会死掉，不知道我有没有说反掉，不过原理就是这样的，之所以能够这样，是因为这个载体的除了带GFP以外，还携带了一个毒性基因，这样就很容易判断这个miRNA是否有研究的价值，具体情况我改天有空再研究一下

myjnqr

谢谢高人指点。我现在遇到一个问题：目前已知和干细胞有关的miRNA中 在我们的样本中信号值低于2000，不是很高；而在我们样本中信号值高，差异倍数大的miRNA没在已知和干细胞有关的miRNA中（这可能是因为我们用的是最新的miRNA芯片），这种情况我应该根据差异大的选还是根据和干细胞相关的选，望您给指点一下。谢谢！

深海寂寞鱼

回复 myjnqr 的帖子+ y/ k" {) s0 X8 X& @, V7 U

+ l# r, _, ^8 s" ito myjnqr兄弟：
* {* B) U3 j2 q& }. ~; @3 ~
$ e# k+ s4 Y) ]/ W; y    我觉得从一下几个方面着手考虑：
" h4 ~: _5 a/ h9 ^1 x- J
8 j$ g' X" L  ?& V    1. 你的样品绝对是干细胞的概率有多高？你是否有功能上的证据？
+ P/ l# ?/ x/ X. w7 B& ^. O. q$ ?: g9 Q
        有时候样品本身可能存在纯度不够，或者已经分化等问题。
0 ?1 f* q4 I* W
4 n  `3 m# X' U5 f       （因为毕竟一些已知的干性相关miRNA在你的样品中确实表达较低）
' a6 {" ~6 k( T6 K* m7 H6 |0 c. D  D8 ~9 a. m$ h
     2. 你做芯片时，是几个样品？或者一个样品是几个重复？6 m: {( A  l9 V5 x2 a

% q, A0 Z' X$ V2 R, X4 o         芯片数据本身也是会有误差的（当然，任何实验都会有）
, D& Y7 c3 {$ t7 p9 [& u4 B! ]+ }  E( N$ V' h
         这个决定了你所获数据的可靠程度。但是为此要付出很高的成本。
* F. v: ]; @0 Y7 \1 k4 n# w" r' l$ E' j
     3. 你所说的“差异倍数大的miRNA没在已知的干细胞有关的miRNA中”
- \1 K) z0 }2 |9 J1 ~( }4 [- u2 I6 u: T# j$ m7 Z6 H. j9 t
         那么就你的知识背景，这些差异倍数大的miRNA在干细胞中有没有研究？
4 {: z7 v+ U( n0 }3 o" l
, L) ~+ x/ J2 d; m8 d4 e         它们中有没有抑制自我更新、促进分化的miRNA？; K3 z. L* q& Q1 N, ~

) [- s# |. C4 y7 _         如果它们之中没有已知抑制自我更新、促进分化的miRNA（或者在分化时会上调表达的miRNA），那么就可以主观推断你可能有新的发现。接下来就是用Real－time PCR去验证你感兴趣的几个差异大的miRNA。然后进行功能研究（上调、下调，靶点预测、验证，生物学功能检测）等等。7 @: d, j; Z+ b. z0 c

! z% C% k( y- `4 N  |4 K         如果它们之中确实有已知的抑制自我更新、促进分化的miRNA（或者在分化时会上调表达的miRNA），那么我们可能得回到第一个问题。你送样时你的样品干细胞的比例或者纯度如何？
. P: x4 {" Z! D- ?$ L0 A) p# c+ n1 {4 O: o) w
        这些只是我个人的一些想法，未必正确。
: l+ d& g& j& g: v0 z4 k1 j9 B" b2 f
. H8 W/ X$ B! f' ?8 y4 R  Y        欢迎多多交流，擦出火花。
: \7 U- b/ m* Z+ N. F2 S; W0 y9 |* z. j" _) H5 H9 j4 A
         

myjnqr

很受益，谢谢啦！我样本里有关干细胞的miRNA信号值虽然低 但是差异倍数很大，这该如何考虑？和不在已知干细胞列但信号值高并且差异倍数大的miRNA 这两部分优先考虑那些？

深海寂寞鱼

回复 myjnqr 的帖子. C. D6 V1 n& o

6 M, ~4 t4 s" a9 k9 N$ uto myjnqr：8 w( `) T$ m4 ^$ ?6 y' T" H

) K5 i/ O1 z) m8 k' {    我觉得差异的倍数大，比单纯的绝对值高，有意义的多。2 Q" p. ]3 F7 ?: G% v/ l. {
$ f( s9 v# _% d7 D
    原因是，绝对值受到的影响因素相对较多，比如  细胞本身的表达丰度，芯片探针的结合效率，荧光素活性等等。所以不同miRNA之间绝对值的大小可以参考，但是不能作为依据。% i- F" F/ a. D2 l" K8 l0 F% ~) J0 E

, p  r: x0 L& ?. q0 K. A; p    与之相反，同一miRNA之间的绝对值之间的差异是具有可比性的。因为结合效率、荧光活性等影响因素都是同等的。所以差异最大的可能性来自于miRNA表达量的差异。+ g6 [1 u2 a& e/ a6 a
6 F" h1 `& ~. ^, L8 U1 W$ k% \8 H( W
     希望这点上我解释清楚了。
% e7 q) z% e3 d' m  T$ v  Y  G! g% ?, P7 J' y; ^
     至于后续的实验是选“已知与干细胞相关的miRNA”还是选“不在已知干细胞相关miRNA之列的miRNA”，我觉得这没有绝对。大概的利弊是这样的。" e) Z8 J3 E$ y; Q7 {, T9 p/ ]2 F5 Z

  @/ y4 U3 ?6 s& P4 C1 D: k     在你目前样品和数据绝对可靠的前提下，
: @. Z! j3 D" y9 f2 M6 {9 i7 K# a- a5 d8 g2 u
     如果你选择“已知与干细胞相关的miRNA”，那么你后续的实验风险相对较低，遇到困难可供参考的文献和经验也多。但是发文章的时“创新性”会降低。同样的工作量和实验费用，换得的文章影响因子会降低。3 i( I) i9 J2 j0 U: I" `

7 ]. I; N! J: F! c     相反，如果你选择“不在已知之列的miRNA”，那么后续实验风险大，或许你用real－time一重复，根本就得不到芯片的结果（芯片的结果可能是一次偶然时间）。如果能用real－time 重复出结果，接着往后面走，有些东西，比如miRNA靶基因的预测与验证，也需要有个自己筛选的过程。但是一旦你能成功，那么文章的创新性可能会高，投稿容易让reviewer感兴趣。后面就是相对好一些的影响因子。9 {) J( W4 o& v8 K2 r5 W( B2 B

' q6 U1 I: T  a) I3 }      但是风险和收益需要你根据自己的实际情况考虑。' `+ W' {: a7 h

# b) \/ `. s, A3 ^; r) H      折中的选择：在你不缺实验经费，又愿意自己付出更多的努力的话，那么你就分别从两类中各选几个miRNA往后做，根据实验结果逐步放下一些，选择一些继续往深入做。这样就是费时费力但是相对降低了风险。
* z( f8 H( j; |
0 H1 z4 r4 W4 C: R. k# {
- p) s% L7 i2 M      唠唠叨叨了那么多，希望能对你有所帮助。- J' a1 Q% i: Y- V8 v

. x& l- \0 K$ a& a      祝实验顺利。

myjnqr

深海寂寞鱼：
7 _1 w& s$ l( u6 s4 p/ a. P$ D. l4 q    很感谢您的帮助，祝愿您在实验中或事业上顺顺利利！

myjnqr

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* M2 ]* g3 F9 O) k# v
. w$ k& s: P5 x深海寂寞鱼：
" u, S1 T" J# o/ K    请问用染料法能区别开高度同源的miRNA 吗？那些后面有abcd的miRNA比如let7 miRNA20a和20b？