求助miRNA筛选方法

myjnqr

请教高人：做完芯片后，面对很多差异表达的miRNA，如何筛选目标miRNA？

深海寂寞鱼

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/ N8 G1 C2 G  }' Sto myjnqr：) K) y* h6 N6 G+ m3 d+ b

, X2 r/ ^8 j( H$ O" j' p- |    看你时关心上调的miRNA还是关心下调的miRNA ？
) H+ t& |/ Q; d
: R: d0 i# Y5 |# a& U    然后选择几个差别相对较大的miRNA，用real－time PCR进行验证。0 e, z- s- P5 B# F0 M  @" A

$ x  `  b1 U2 ~- K& T7 K    下来再根据real－time PCR的结果选择差别较大的miRNA作为你的目标miRNA，进行功能验证。. P. |3 G0 o  e+ Y5 r# Z5 f% j! c; q% F

* X5 N; E4 Y# D" c    这只是一个粗略的框架。# W* X. Y3 W% C: q+ p9 B+ A1 L+ Y
0 i" g5 \  A2 s& a7 P% h  _6 j3 q2 K
    你多看看文献就明白了。% p+ z6 ?$ H% [) M
( u# h5 T" K2 [2 \" e6 A& y) @
    欢迎继续交流。

64627675

昨天刚学到的，大致说一下，如有不妥之处望高手们莫笑，流程如下，把你认为可能有效的miRNA序列构建到一个载体上（重点就在于这个载体），用该载体转目的细胞，后加入一种药物，如果有作用则被转染的细胞能继续存活，如果没有作用细胞就会死掉，不知道我有没有说反掉，不过原理就是这样的，之所以能够这样，是因为这个载体的除了带GFP以外，还携带了一个毒性基因，这样就很容易判断这个miRNA是否有研究的价值，具体情况我改天有空再研究一下

myjnqr

谢谢高人指点。我现在遇到一个问题：目前已知和干细胞有关的miRNA中 在我们的样本中信号值低于2000，不是很高；而在我们样本中信号值高，差异倍数大的miRNA没在已知和干细胞有关的miRNA中（这可能是因为我们用的是最新的miRNA芯片），这种情况我应该根据差异大的选还是根据和干细胞相关的选，望您给指点一下。谢谢！

深海寂寞鱼

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' s3 d% S8 C& o) Ato myjnqr兄弟：
# l- w' y& S% y/ j% {+ r  Z- P8 R- u9 J' I
    我觉得从一下几个方面着手考虑：
' W. _4 `+ Q; |
9 E$ }! j9 q. s& c, h    1. 你的样品绝对是干细胞的概率有多高？你是否有功能上的证据？
. V7 k. _3 F* w9 s3 |
* U8 N. j0 v/ B. j        有时候样品本身可能存在纯度不够，或者已经分化等问题。, i" K2 i/ t4 c0 N$ ]

( f) M, r( l2 O1 n* [4 b* }       （因为毕竟一些已知的干性相关miRNA在你的样品中确实表达较低）
4 l! I8 y* v- t/ l# A9 b/ r% T  j5 N; O2 s! Q. E8 E1 w  }+ `
     2. 你做芯片时，是几个样品？或者一个样品是几个重复？
( B- J! _+ q* N3 c* Z6 ?- \5 n# }9 j$ K) h
         芯片数据本身也是会有误差的（当然，任何实验都会有）
& J% _  ^& W2 q6 Q0 |# _" E" w1 K" x
+ B0 Z% u% n" e  r         这个决定了你所获数据的可靠程度。但是为此要付出很高的成本。/ {2 z  p) ^+ U  P1 L( U/ X/ C
0 H* \# R! F! d% D; B
     3. 你所说的“差异倍数大的miRNA没在已知的干细胞有关的miRNA中”
0 E3 h4 M4 z4 A$ u* j1 n( T
  l: ^& E$ V$ \         那么就你的知识背景，这些差异倍数大的miRNA在干细胞中有没有研究？
. P# ^9 i5 p2 u3 m. \4 A( O0 D  Y5 y! I
         它们中有没有抑制自我更新、促进分化的miRNA？+ b: f+ b. x3 \9 [4 N+ C3 d
( A* C/ k! Y% S7 g
         如果它们之中没有已知抑制自我更新、促进分化的miRNA（或者在分化时会上调表达的miRNA），那么就可以主观推断你可能有新的发现。接下来就是用Real－time PCR去验证你感兴趣的几个差异大的miRNA。然后进行功能研究（上调、下调，靶点预测、验证，生物学功能检测）等等。
# @4 w+ x/ ~# f5 u; D* X1 n; a0 q5 {  \0 K
         如果它们之中确实有已知的抑制自我更新、促进分化的miRNA（或者在分化时会上调表达的miRNA），那么我们可能得回到第一个问题。你送样时你的样品干细胞的比例或者纯度如何？
3 s% L% a) c( |( t/ d1 n1 F. m* q7 e- D6 o% A" P1 }
        这些只是我个人的一些想法，未必正确。
8 i. }0 `" K& J( ~9 _! r* h2 F- l& m
        欢迎多多交流，擦出火花。$ l) ?% c  C, J) B2 E

/ n& c& M* N4 X# r) o" J         

myjnqr

很受益，谢谢啦！我样本里有关干细胞的miRNA信号值虽然低 但是差异倍数很大，这该如何考虑？和不在已知干细胞列但信号值高并且差异倍数大的miRNA 这两部分优先考虑那些？

深海寂寞鱼

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% ~/ j8 |/ @4 i7 O& @0 y9 o% m/ d5 O# I# F* g4 f4 S1 [
to myjnqr：
4 y* Z$ J1 q7 s2 i0 \
3 P( K' {% w6 V) ~' Y) ?) w    我觉得差异的倍数大，比单纯的绝对值高，有意义的多。/ p5 A% t$ B/ J+ d

& ^0 i( M: d  {4 A4 r* ~: L    原因是，绝对值受到的影响因素相对较多，比如  细胞本身的表达丰度，芯片探针的结合效率，荧光素活性等等。所以不同miRNA之间绝对值的大小可以参考，但是不能作为依据。1 p2 G3 \. H, D7 m

# o1 [1 A; ~; O# [    与之相反，同一miRNA之间的绝对值之间的差异是具有可比性的。因为结合效率、荧光活性等影响因素都是同等的。所以差异最大的可能性来自于miRNA表达量的差异。0 y* H# T/ a4 C4 X* C' `7 o
, y  Y# Q+ u3 Q  O( [( T1 `& {
     希望这点上我解释清楚了。/ c4 t) \; N3 `" Y9 f+ w7 d4 x
8 H' c: b  }2 R  X) B5 z; a" w
     至于后续的实验是选“已知与干细胞相关的miRNA”还是选“不在已知干细胞相关miRNA之列的miRNA”，我觉得这没有绝对。大概的利弊是这样的。4 _! R, m; @, Q) |- Z8 D

% S5 t% ~0 ?  W! H     在你目前样品和数据绝对可靠的前提下，& v1 @% ?* u6 Z  A9 h8 _( n
4 s( k' M* p. s+ z" h
     如果你选择“已知与干细胞相关的miRNA”，那么你后续的实验风险相对较低，遇到困难可供参考的文献和经验也多。但是发文章的时“创新性”会降低。同样的工作量和实验费用，换得的文章影响因子会降低。
. R$ ~. q' z. k2 c, ?3 e' a! K
: x- }6 A% }: w( `! ?7 g     相反，如果你选择“不在已知之列的miRNA”，那么后续实验风险大，或许你用real－time一重复，根本就得不到芯片的结果（芯片的结果可能是一次偶然时间）。如果能用real－time 重复出结果，接着往后面走，有些东西，比如miRNA靶基因的预测与验证，也需要有个自己筛选的过程。但是一旦你能成功，那么文章的创新性可能会高，投稿容易让reviewer感兴趣。后面就是相对好一些的影响因子。
$ D/ L; f8 y" T
5 S: G/ i) w* O5 x. ?      但是风险和收益需要你根据自己的实际情况考虑。
, J7 z. |. w0 I4 Q+ p! {
" t0 j, E" C3 J4 F% x' j: h1 y      折中的选择：在你不缺实验经费，又愿意自己付出更多的努力的话，那么你就分别从两类中各选几个miRNA往后做，根据实验结果逐步放下一些，选择一些继续往深入做。这样就是费时费力但是相对降低了风险。
. b$ R0 _6 R6 `. q* O, S8 [* K3 s# _8 O1 D/ |
# m9 p8 Y7 r: v& o# v  n
      唠唠叨叨了那么多，希望能对你有所帮助。5 y' h* W/ q/ |1 u" u+ ^6 F! i

' k: J- C( K$ Y0 I3 |4 @6 u      祝实验顺利。

myjnqr

深海寂寞鱼：( p3 q& p3 X, r% e& [
    很感谢您的帮助，祝愿您在实验中或事业上顺顺利利！

myjnqr

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% M: a2 i# h  v' l! n7 }7 }8 g+ W; N# O/ o1 l
深海寂寞鱼：
# F1 ~  U4 d# L& r4 J2 [" F    请问用染料法能区别开高度同源的miRNA 吗？那些后面有abcd的miRNA比如let7 miRNA20a和20b？