为什么筛个稳转株这么难

mckf111

现在用pEGFP-IRES2载体转染黑素瘤B16F10细胞 筛选前转染效率有20% 先1：10传代 再用700-1100mg/L G418分组筛选 基本3天后就没什么绿的了 我晕 两个月啦 就这么耗时间 后面实验。。。
! J3 e' y  p0 |3 v& g- \& J: f大家有什么建议啊

runsong

pEGFP-IRES2表达gfp就是不稳定，我也遇到过转pEGFP-IRES2的细胞过两天就不亮了。据说是因为IRES启动gfp的效率太低。
6 N% k3 H8 a1 N4 s你要不用pEGFP-C1试试。

jiays

建议用慢病毒转导吧，效率可以达到90%，我也是同样的情况3个月只筛出一个稳定株，用慢病毒1个月搞定了4株，后续试验也比较稳定
4 x. z+ B2 D5 t

mckf111

回复 jiays 的帖子) j  w) ~1 G0 d* p3 \, ?
( l: r; f6 _$ D% L8 V  Z% H3 y
咱们实验室级别不够啊 哪有那东西

mckf111

回复 runsong 的帖子3 j; B7 i! e& x
6 {0 o; c, K" |; z1 C+ s
实验室没这种质粒 你能惠赠点么

jiays

可以，共三个质粒，你有293T细胞 就可以包被

runsong

回复 jiays 的帖子- V- {, T6 I4 e7 W4 h: I5 J/ m

. `  S6 b$ `# R% _( }7 N# D7 {$ A# p你好，我也在做慢病毒的东西。用的是别人赠送的包装质粒，用293t包，但感染效率太低。你能把你们用的载体图谱和操作步骤发个我吗。
9 {" k( Z# M: _+ M+ t6 p5 R邮箱：5595758@163.com
' A; q; a  @/ [) X4 O不胜感激！

mckf111

顶起

ambassador

试试PMXS-IRES-Neo这个载体，抗卡纳霉素抗性！估计效率高些。。。
. ~3 Z* z- j( n5 h. @
& `; a6 K7 K+ d6 h9 U不过如果要插入GFP，就不知道会不会降低它的效率了!