为什么筛个稳转株这么难

mckf111

现在用pEGFP-IRES2载体转染黑素瘤B16F10细胞 筛选前转染效率有20% 先1：10传代 再用700-1100mg/L G418分组筛选 基本3天后就没什么绿的了 我晕 两个月啦 就这么耗时间 后面实验。。。
1 Q4 {3 b: M6 J4 e大家有什么建议啊

runsong

pEGFP-IRES2表达gfp就是不稳定，我也遇到过转pEGFP-IRES2的细胞过两天就不亮了。据说是因为IRES启动gfp的效率太低。! \0 Q" A7 M& }. d7 [, P# B- X
你要不用pEGFP-C1试试。

jiays

建议用慢病毒转导吧，效率可以达到90%，我也是同样的情况3个月只筛出一个稳定株，用慢病毒1个月搞定了4株，后续试验也比较稳定
) n& \, F) `+ J/ r, o

mckf111

回复 jiays 的帖子0 l+ x4 i& u! J. P+ P
# `0 h- u) g) ~; v% @' b) ]
咱们实验室级别不够啊 哪有那东西

mckf111

回复 runsong 的帖子
3 b9 Z0 A0 x' E
3 A- [3 X- {& J  v$ I$ a5 _8 b4 w实验室没这种质粒 你能惠赠点么

jiays

可以，共三个质粒，你有293T细胞 就可以包被

runsong

回复 jiays 的帖子4 j, Z2 {/ u: V) _

$ r# r0 C! x! i+ V8 L. B你好，我也在做慢病毒的东西。用的是别人赠送的包装质粒，用293t包，但感染效率太低。你能把你们用的载体图谱和操作步骤发个我吗。
7 a5 t4 M' h/ d6 Q. P+ f/ Q邮箱：5595758@163.com- O5 j1 z& o' B! ~
不胜感激！

mckf111

顶起

ambassador

试试PMXS-IRES-Neo这个载体，抗卡纳霉素抗性！估计效率高些。。。9 e( }' M1 n. L4 z. t
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不过如果要插入GFP，就不知道会不会降低它的效率了!