蛋白银染的问题

hndxws

今天做了第一次银染，在网上搜了好几种protocol，最后觉得这个步骤用的人比较多。) [3 b3 a$ {* z$ ]: O2 l6 M" X$ U
步骤 溶液 时间
2 o, U/ \* S  @8 B" a9 j固定 甲醇 100ml、冰醋酸 25ml、加双蒸水至250ml 30min9 u' T. U4 o! P1 U
冲洗 双蒸水 3次
9 P/ s# f- @3 Q敏化 甲醇 75ml、戊二醛（25%w/ 1.25ml、硫代硫酸钠(5%w/) 10ml、醋酸钠（17g）加双蒸水至250ml 30min
- x* |% p. P) l& f% }冲洗 双蒸水 3次2 ]* ]# B: }; ~3 b& x: F  p+ F  D5 \
银反应 硝酸银溶液(2.5%w/) 25ml、甲醛(37%w/) 0.1ml加双蒸水至250ml 20min; Q1 S& {. t% v" j$ m
冲洗 双蒸水 2次5 Y4 j' Z6 v$ N5 ~/ x
显色 碳酸钠(6.25g)、甲醛(37%w/) 0.05ml 加双蒸水至250ml    2-5min
% M4 y9 T- r4 I- W7 p4 f终止 EDTA-Na22H2O(3.65g) 加双蒸水至250ml 10min
; R/ F$ }9 s0 Q0 e! B冲洗 双蒸水 3次( P0 D( h, }% L5 S* f- v5 Y8 G0 y
: {* _2 J, K2 `, u# [
我按着步骤配了溶液，然后染色。当我加了银染液后，没一会胶就变黄了。看protocol上说是加显色液时才会变黄，当时我就很诧异。接着该加显色液了，加了大概5分钟，胶变灰了，胶上什么条带都没有。胶整个都是灰色的。专家们帮我分析分析我哪个地方出问题了，我觉得溶液应该没问题吧。

zxcv12345

回复 aminhair 的帖子' h3 M: C8 P2 W9 \! c  ]4 k
3 T$ d  w' O  u1 I' y
啥意思？

aminhair

哇，哇，哇。。。来晚了。。。

zxcv12345

不要用双蒸水
& F# }# Z0 J' t- Q9 u% q' ^用去离子的， 双蒸水 的某些离子会和agno3反应
, S0 p3 s3 ~- x若用去离子水，也要经常给机器换滤头，以免去离子不净' `3 n; |" K9 H5 k0 V- [7 D' O% U

hndxws

避光是不是很关键啊？再做了一次，还是加了银染液后不到一分钟就变黄，后面的显色也没变化了。试剂都是新的，问题出在哪了？。, A! P6 [7 w( R3 i- J
最后，我又重新来了一次，没有前面的固定、敏化，这时加了AgNO3染液胶就一点变化都没有，所以我觉得银染的避光没那么重要，以至于让胶直接变黄。我觉得问题主要出在固定和敏化，因为经过这两部处理后的胶加了AgNO3，才变得很黄的。但是，前面出了什么问题，我很郁闷啊？

王乾

我现在也在做银染，目的是切胶去打质谱，刚开始染得确实很烂，不过经过几次摸索之后现在染得还相当不错，总结我自己和其他人的经验我觉得银染应该注意的事项:
% t& R% y% r  [1. 银染主要出现在胶的表面，用薄胶（0.5-0.75mm）可以提高灵敏度。
8 a. i, L" ?2 ~  k2. 对于考马斯亮蓝染色的胶，可用甲醇将胶漂洗后，继续进行银染。乙酸会干扰银染，因此要确保将凝胶中的乙酸彻底洗净。如果凝胶被过度银染，可用Rapid Fix脱色，并用考马斯亮蓝二次染色。/ m7 C* @% e: X7 e% H, m6 e
3. 不同蛋白质对银染的反应是不一样的，尤其是碱性蛋白染色效果差。因此，不宜用银染测定不同蛋白的比例。# U) J' V2 ^5 Z! R' h9 ]
4. 染色过程中，缓慢的振荡是必要的，一般选择40-60 rpm.* }0 q% j$ s4 D# I2 A
5. 凝胶表面的裂纹多是由于压力、手印及表面干燥所致，所以全程操作中都应带手套。
. y  G; d3 P* v1 U1 c( g6. 凝胶背景呈均一的黑色多是水中的杂质引起的，所以溶液的配制应使用电导率小于1 μS的去离子水。8 ~  v1 r! w' w7 b% A
7. 如果染色后有呈灰尘或烟雾状灰色或棕色的沉淀出现在凝胶表面，可能是在几步漂洗过程中洗得不够彻底，或是染色过程时温度太低。
( _2 p) x; d5 R3 S8. 较深的银染背景多是丙烯酰胺中的杂质所致。# C0 Z& k! {( L3 s, L9 q/ _' ~) C( L

fananran2003

敏华长短影响不大，就是缩短银染后显色是的时间，试剂新的没问题，你的溶液也都是新的吗？想硝酸银，显色液都容易失效，最好现配，反正也不麻烦

hndxws

我是第一次做，试剂都是新的。难道是敏化时间长了?

fananran2003

敏化2-5min就行

fananran2003

我发个简单的配方，我一直用还挺好用，4 m" V) F8 ^9 c/ o, m% ]4 D
固定 甲醇 250ml、冰醋酸 25ml、加双蒸水至500ml ,30min,水洗2x2min，后水洗1h。
9 H' B& f$ p* E( V, N0 T2 J/ A+ w敏化 硫代硫酸钠0.1g加双蒸水至500ml,冲洗 双蒸水 2x30s
1 r/ P9 F1 y3 Y8 u银反应 硝酸银0.5g加双蒸水至500ml，避光孵育30min，冲洗双蒸水 2次x5min % `; x5 ]2 p% y* d. x6 I. ^
显色 碳酸钠10g加双蒸水至500ml，甲醛500ul，现用现加。
5 p5 u, c$ N" P  o2 p' R终止 观察至想要效果，1%的冰醋酸终止，