求胚胎干细胞的冷冻方法

王乾

不同实验室有不同的冻存方法，其实只要是操作没问题，没有太大区别，下面是我们实验室的冻存液的配方，和冻存即复苏方法，希望对你有用。
8 M6 H- m2 m/ m/ |细胞冻存（缓存）! Q9 B" z: x9 }+ z
1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可吹打脱落。
% B) Z2 U5 T5 ?) j& R1 u; `6 v1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）) \+ ]/ n8 Y( i" t0 L& V6 z
2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:7+ _# g5 R7 D( [4 A
3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。
" e, v; A9 |! V% [3 N7 b4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。（冻存细胞程序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为宜。）' n2 Q& X, m' g% o

* I$ ^) g8 l3 e细胞复苏（速溶）
: m5 ~% ?/ U0 `. E8 {# }& y& U冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。+ `. x1 I, Z; ~! x/ x3 W
计算存活率，取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。9 B+ l$ ]) P! _* c; v
（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％
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