求胚胎干细胞的冷冻方法

congxiaoran

请教下如何冷冻干细胞 怎么操作和需要哪些液体 谢谢

nculsa747

自己先找一下嘛，非常简单。90%KSR+10%DMSO。细胞冻存液有现在的，如cellbanker、millipore都有，去找一下吧。

王乾

不同实验室有不同的冻存方法，其实只要是操作没问题，没有太大区别，下面是我们实验室的冻存液的配方，和冻存即复苏方法，希望对你有用。; d; E  I. b# g6 E' O/ A% W
细胞冻存（缓存）
  n: z  `3 \/ Y/ `/ N9 R$ x1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可吹打脱落。
5 X, ]( `  q* @& g4 ?. U1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）' m! i/ p1 ]* n  g
2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:74 G8 U* m7 x: G# i5 N8 n1 l$ p
3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。
+ k% `& L; o6 t" a* `4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。（冻存细胞程序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为宜。）5 p0 ]! B% z, I& B. N( i2 @+ K
% P. T+ k: p: n
细胞复苏（速溶）
6 E4 G! @  n) z冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。# K* ^1 V6 s7 L# t# P* \! Y
计算存活率，取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。
, C3 D# r) e+ S  E- Z" a) n1 t（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％. t3 d( O0 t! D; P2 Q

随心

这边做的是小鼠胚胎干细胞，用3.5cm板养的，具体步骤如下：
8 E1 n% W' ]2 p4 C, j1 @: ]- I1 X" {1.提前将保温杯放入-20℃待用./ @9 \: }" V9 f  ^& [  L) z- [% _
2.提前两小时给干细胞换液.
) `5 E& ^9 l* L3.开始冻存,把培养基去掉,用pbs洗一至两遍，加1ml胰酶消化1min。
8 s1 k) R: q$ q) Y8 n9 Z5 E: ]4，去掉胰酶，加1ml培养基把细胞吹打下来，加入离心管，1000r，一般我们离7min。
8 k$ Q, ?) x& n* m! z+ [9 ^+ M5.加入1ml培养基吹打均匀
' e& S& L/ q4 r. g" Q  u) t$ `4 F, u6，加入10%-15%的二甲基亚砜，根据细胞的多少，大概冻几管，计算好DMSO的量。一般一管2乘10的六次方左右最好。: R  s$ s* h6 b+ H/ v; S
7，分装冻存管，每管大概总液1ml.
# E+ H. x2 c7 D/ f9 Q8.把冻存管放入预先准备好的保温杯中。4 V5 V: I+ e* [- c
9，送至-80℃过夜。- w3 N5 ]7 S4 H; S4 s* o: A+ g
10.第二天一早转移至液氮中，做好记录就可以了。
" s# I) w1 V6 y. o& y7 _我们一般晚上冻存，这样做完直接送至-80℃过夜了，时间正好。

congxiaoran

回复 王乾 的帖子. ^+ ~% K, h3 G% Y" y. t

; Z- y' B& z( W6 }0 Z非常感谢

congxiaoran

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' K  b6 x+ _, k( X( c! D, Y" D( F: p, S; O+ m5 G
多谢 受教啦

congxiaoran

回复 nculsa747 的帖子; F6 Q: V) y7 U3 A" N$ A+ P
' X2 |7 \' g: c  U/ W
谢谢

congxiaoran

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# t' @/ m) ^7 _& o+ w9 p0 O
; P# V/ V6 G+ e' Y不好意思想问您 KSR是什么？应该买哪个牌子的？多谢

HMC

最好使用10%DMSO+90%FCS进行冷冻，这样效率更好！

nculsa747

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( V- }2 U2 R" z7 }% Tknockout serum ,血清替代物，Gibco的。9楼说的FCS即FBS，hESC最好不要用它。