求胚胎干细胞的冷冻方法

congxiaoran

请教下如何冷冻干细胞 怎么操作和需要哪些液体 谢谢

nculsa747

自己先找一下嘛，非常简单。90%KSR+10%DMSO。细胞冻存液有现在的，如cellbanker、millipore都有，去找一下吧。

王乾

不同实验室有不同的冻存方法，其实只要是操作没问题，没有太大区别，下面是我们实验室的冻存液的配方，和冻存即复苏方法，希望对你有用。" X2 w7 c5 I- U& y7 E4 R
细胞冻存（缓存）8 }* [6 X. l1 ]* b0 v
1、0.25％trypsin（或＋0.02％EDTA）消化5min左右，镜下见细胞回缩间隙增大，即可吹打脱落。1 x) q& K, T$ U3 }$ M0 w- v
1、800r离心5分钟，2次（无EDTA，离心一次即可）. h! a( y# l* [' V
2、配制冻存液：甘油:血清:完全培养基=1:2:7
, o) p6 I3 R* ~0 ^3、50ml培养瓶的细胞（约5×105），用1ml冻存液重悬细胞，放入冻存管中。3 P, V. o* G% j) V
4、冻存步骤：4℃1h——－20℃1h——-－80℃1h——- -196℃液氮冻存。（冻存细胞程序性降温，4℃放置时间40min以上，3h以内，－20℃对细胞损伤最大，1h左右为宜。）
# s% b4 ?' Q0 H: P4 I% H# o! |2 q  N
细胞复苏（速溶）
! \" V1 ]1 o) }6 u! x冻存管直接投入37℃水浴，平摇直至融化，种于50ml培养瓶中。根据细胞贴壁情况换液（一般24-36h换液）。9 P0 T5 u0 a- ]# T9 f, H6 o
计算存活率，取一滴冻存细胞悬液，台盼兰染色，活细胞不上色，死细胞染成兰色，计算细胞存活率。& a6 W; R* u, x7 |5 W
（细胞总数－死细胞数）/细胞总数×100％7 Z, I$ D2 U- u# n

随心

这边做的是小鼠胚胎干细胞，用3.5cm板养的，具体步骤如下：
, _" S6 ^1 [4 @) c8 ^1.提前将保温杯放入-20℃待用.
7 C6 H! C0 k  V5 p2.提前两小时给干细胞换液.
3 S) l0 U" x$ m  x. x- u; t( s% V3.开始冻存,把培养基去掉,用pbs洗一至两遍，加1ml胰酶消化1min。
0 f* S5 Z- Q2 e( L9 l+ n4，去掉胰酶，加1ml培养基把细胞吹打下来，加入离心管，1000r，一般我们离7min。% W& g9 j& P8 Z% a4 Q
5.加入1ml培养基吹打均匀
7 A1 L5 Y; b) _6，加入10%-15%的二甲基亚砜，根据细胞的多少，大概冻几管，计算好DMSO的量。一般一管2乘10的六次方左右最好。. e9 B/ d- N/ ^5 ?. ]% _
7，分装冻存管，每管大概总液1ml.
0 G5 ^' R# K1 Q8.把冻存管放入预先准备好的保温杯中。) s( K9 S3 w" l1 @0 V4 s" d
9，送至-80℃过夜。
5 M& K  U3 V. K" p, r10.第二天一早转移至液氮中，做好记录就可以了。; h( A9 R/ h# _% Y/ h$ ]
我们一般晚上冻存，这样做完直接送至-80℃过夜了，时间正好。

congxiaoran

回复 王乾 的帖子
0 |; {0 y; f  C1 Q6 {* k2 }3 Q0 K  h% X% T% @8 L
非常感谢

congxiaoran

回复 随心 的帖子% }9 F: O8 R8 G2 Y

" b* O( X; v% w/ \$ J& G% Y多谢 受教啦

congxiaoran

回复 nculsa747 的帖子6 G# x/ V5 B' _* G/ y. g0 {! N. C
8 Z! D3 w' \( u9 T
谢谢

congxiaoran

回复 nculsa747 的帖子
, j  F1 S- c! q: o+ W1 D$ G+ Z1 u5 R* B0 }6 |
不好意思想问您 KSR是什么？应该买哪个牌子的？多谢

HMC

最好使用10%DMSO+90%FCS进行冷冻，这样效率更好！

nculsa747

回复 congxiaoran 的帖子$ _) ^+ m* y) W+ i. ]
5 F. r% O6 |; y+ s4 {
knockout serum ,血清替代物，Gibco的。9楼说的FCS即FBS，hESC最好不要用它。