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1 D2 y9 o9 ~; E. b6 Z3 Da)成脂分化诱导培养基的配制! g% Z4 h& x1 K0 P0 L7 ^
将胎牛血清及添加物加入基础培养基配制成脂分化诱导培养基A和B，将配好的分化完全培养基过滤除菌，储存在4℃。 ) u. t) B1 F$ s& A9 G o
成脂分化诱导完全培养基A： / t( t8 f6 W# I9 N4 k
成脂分化诱导基础培养基A 175 mL / h. c8 g# e6 a5 }
Fetal Bovine Serum（胎牛血清） 20 mL , h# B' q0 Z6 P# h
Penicillin-Streptomycin（青链霉素） 2 mL
3 N0 |+ O$ R+ _/ `# cGlutamine（谷氨酰胺） 2 mL % \- c; a/ `- c/ g9 H8 \. |
Insulin（胰岛素） 200μL # X% f" \5 [$ q; E5 d, S) V
IBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤） 200μL 9 R1 J1 h8 |2 y! o' f
Indomethacin（吲哚镁锌） 200μL
3 {1 H" N9 q3 Y' dDexamethasone（地塞米松） 200μL
/ f! C9 M6 ~- l; b7 {7 [, x8 M& J成脂分化诱导完全培养基B：
1 w) b2 ~2 _) R" g& d# H d成脂分化诱导基础培养基B 175 mL
. D: O% j6 s( I: [9 g; x! M& x/ t! wFetal Bovine Serum（胎牛血清） 20 mL
1 t; ~1 i0 D" @+ z0 zPenicillin-Streptomycin（青链霉素） 2 mL
! n6 |6 k/ [1 }7 U3 QGlutamine（谷氨酰胺） 2 mL ; A1 o, }: |: p. d: v( _7 Q6 M+ Y3 h
Insulin（胰岛素） 200μL
, h0 h- @* [$ r3 R
: P$ X0 f" j0 Sb)诱导分化： % o t# A4 r( I' Q3 M" ?" Z) H5 W
1)取P3代细胞，2×105/孔的密度接种到六孔板。
& m4 ~3 k3 ^6 R" b( T% U2)37℃，5%CO2培养。 t/ ?: l1 o" \# @& v1 m
3)每隔 3 d换新鲜生长培养基至细胞完全汇合。 ) l* ^4 r+ n Q) r2 Z0 m8 b
4)吸去上清培养液，每孔加入 2ml 的成脂分化诱导完全培养基A。
4 W+ @+ _! Z5 j9 X5)三天后，将分化诱导液换为成脂分化诱导完全培养基 B。 * d) O9 i8 m: Y" @0 ^; t" k
6)24 h后，再换回成脂分化诱导完全培养基 A 进行诱导。 % T( R# R* O/ y7 V7 w
7)循环 3～5 次后，用培养基 B维持 7 d，每三天进行换液。
* q! l, y( j9 N/ }: J0 ]! K- \8)分化诱导3 周后，固定细胞并用油红O进行染色。$ h8 d2 L& B: M w3 r
- N8 Q4 ~1 _1 @) ]8 _! z
c)油红O染色
$ J% H5 h3 u: F0 t' \+ [1)去除诱导培养基，PBS 洗两次。4%中性甲醛固定 30 min。
$ \( Q6 h9 B4 |7 {5 M2)吸去固定液，PBS 洗两次。每孔加入 1ml 的油红O染色 30 min。
) O- O/ p) h1 q' y7 }3)去除染色液，并用PBS 洗两次。拍照。4 y0 e# A$ Y+ J. J, t* A" M1 E8 C' ^
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发表于 2011-5-3 14:26
发表于 2011-5-3 14:51
