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! I! K; x4 z z2 U9 ?
a)成脂分化诱导培养基的配制
: ]3 v% d! R" ?! T5 ]! D将胎牛血清及添加物加入基础培养基配制成脂分化诱导培养基A和B，将配好的分化完全培养基过滤除菌，储存在4℃。
6 o5 t5 I' l# m成脂分化诱导完全培养基A：
# }/ v4 {2 N1 R- D成脂分化诱导基础培养基A 175 mL
7 E- L3 N+ Y" C CFetal Bovine Serum（胎牛血清） 20 mL
/ f+ O3 V9 Q$ ~; cPenicillin-Streptomycin（青链霉素） 2 mL + y% R2 s# z) r; {. t8 M1 e
Glutamine（谷氨酰胺） 2 mL ' S6 o5 m2 D2 X$ K
Insulin（胰岛素） 200μL
- e& y1 X2 X7 y/ v; w. F+ f" kIBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤） 200μL
5 [$ O% I" @9 ?* E$ l: xIndomethacin（吲哚镁锌） 200μL 5 m( V. H; }6 W/ u# a) G% e3 _/ R
Dexamethasone（地塞米松） 200μL
* I! h& A& x( M8 J: S成脂分化诱导完全培养基B：
2 H7 F% u+ d9 w$ O2 x. z6 p) ~成脂分化诱导基础培养基B 175 mL
9 h) v/ m- ^( X7 b* |3 \, ?Fetal Bovine Serum（胎牛血清） 20 mL 4 Q( O) }9 x$ i+ ~
Penicillin-Streptomycin（青链霉素） 2 mL - z9 P2 X; f0 |! ?
Glutamine（谷氨酰胺） 2 mL 3 _: {0 @+ |9 l# Z) ]
Insulin（胰岛素） 200μL
) V9 N/ `. H6 R* {' N7 U+ P7 u# H
8 a! v0 }5 Y0 ~! n0 f4 [1 mb)诱导分化： 2 q9 a- o' D4 k1 y" f+ h
1)取P3代细胞，2×105/孔的密度接种到六孔板。! o+ c, a" ]& R2 Y1 @% V
2)37℃，5%CO2培养。 8 f2 a9 Q$ _$ z9 d$ d0 @
3)每隔 3 d换新鲜生长培养基至细胞完全汇合。
: K" j+ [- h& @' |3 T4)吸去上清培养液，每孔加入 2ml 的成脂分化诱导完全培养基A。 / Y2 r3 i& ]! `* y5 K
5)三天后，将分化诱导液换为成脂分化诱导完全培养基 B。 1 P$ l% R" R/ _$ j: }0 [; O
6)24 h后，再换回成脂分化诱导完全培养基 A 进行诱导。 Q. V5 Z' j6 }% `
7)循环 3～5 次后，用培养基 B维持 7 d，每三天进行换液。 ) J9 b5 \* A' J1 `
8)分化诱导3 周后，固定细胞并用油红O进行染色。
* Y5 S% P# Z6 M% r7 `& u3 i3 P: b$ s8 t. C) ~( l t: M
c)油红O染色 & c; h9 j) W) A) y/ a
1)去除诱导培养基，PBS 洗两次。4%中性甲醛固定 30 min。
% I; L) x9 r9 O3 f; }2)吸去固定液，PBS 洗两次。每孔加入 1ml 的油红O染色 30 min。 0 N& P4 u. T6 d$ m1 n8 P# b/ b
3)去除染色液，并用PBS 洗两次。拍照。
! W7 N2 }5 ]! \, h4 v& y" P. K |
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发表于 2011-5-3 14:26
发表于 2011-5-3 14:51
