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* R* W K& L7 o8 [ {; t, P
a)成脂分化诱导培养基的配制/ \5 t( [3 H7 z0 v4 L# i
将胎牛血清及添加物加入基础培养基配制成脂分化诱导培养基A和B，将配好的分化完全培养基过滤除菌，储存在4℃。
% K7 M# ~" x' r1 j4 k成脂分化诱导完全培养基A： + l) b I! ~1 s2 E" E
成脂分化诱导基础培养基A 175 mL
$ m& {4 P! k5 d3 CFetal Bovine Serum（胎牛血清） 20 mL
3 Y! D/ I, Z7 S8 z. yPenicillin-Streptomycin（青链霉素） 2 mL
) K/ R" i+ y) a* mGlutamine（谷氨酰胺） 2 mL
7 @# h& W; ]' l) \: J+ k8 ~Insulin（胰岛素） 200μL
' k" [$ B3 k5 Y, ]/ MIBMX（3-异丁基-1-甲基黄嘌呤） 200μL
" M' `- {+ s3 p/ V ^Indomethacin（吲哚镁锌） 200μL - X0 r2 x T* Y- r$ x, s' P7 H' U
Dexamethasone（地塞米松） 200μL
2 r/ L( `8 G5 z9 D- y0 ]( o) T成脂分化诱导完全培养基B：
0 v! x, S5 d. M1 |: m! P: {1 B成脂分化诱导基础培养基B 175 mL
. k% O: `* Y1 zFetal Bovine Serum（胎牛血清） 20 mL
& B7 y. l; f4 s! j1 DPenicillin-Streptomycin（青链霉素） 2 mL 6 E4 j1 s* E0 ]4 J2 [) e
Glutamine（谷氨酰胺） 2 mL
0 ?; I' G; I8 L$ R6 P( o& hInsulin（胰岛素） 200μL
8 _2 C" [# ?) `3 C9 u/ k5 C% s: K
) m: ?7 w$ r. xb)诱导分化：
) ` O7 Z8 R7 K# i4 ^5 L1)取P3代细胞，2×105/孔的密度接种到六孔板。- B! s/ D; }) \" G
2)37℃，5%CO2培养。 + r( q/ [6 x- ~1 B \" E. Z2 L, Y' I
3)每隔 3 d换新鲜生长培养基至细胞完全汇合。
# k& l6 l/ n1 T4)吸去上清培养液，每孔加入 2ml 的成脂分化诱导完全培养基A。
7 ?+ A1 [" q7 q) t6 n) q5)三天后，将分化诱导液换为成脂分化诱导完全培养基 B。 8 ]- `2 V: A6 H) V; k6 N
6)24 h后，再换回成脂分化诱导完全培养基 A 进行诱导。
/ I. i C* h4 ?3 v! w7)循环 3～5 次后，用培养基 B维持 7 d，每三天进行换液。
$ B' ]$ r% C; f* a- H0 I8)分化诱导3 周后，固定细胞并用油红O进行染色。
5 Z8 N; B; S! M6 k) ]
" B% e9 i6 K9 y2 A' Z8 A& f+ w( ?8 Sc)油红O染色 ' C% @+ z, M( y4 k, M
1)去除诱导培养基，PBS 洗两次。4%中性甲醛固定 30 min。 7 U3 {2 F) {" E9 n$ V1 F
2)吸去固定液，PBS 洗两次。每孔加入 1ml 的油红O染色 30 min。
`! M+ [% K9 b& P8 q3)去除染色液，并用PBS 洗两次。拍照。
' d/ c& ?& k' y8 Z |
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发表于 2011-5-3 14:26
发表于 2011-5-3 14:51
