关于mESC传代密度与其细胞状态维持的问题

dilal

ESC传代密度让人很纠结，养了半年细胞了也不是很清楚。师兄告诉我ESC可以传的稀一点，因为ESC自我增殖能力很强，单个细胞可以长成一个集落。从来没有细胞计数过，显微镜下目测低倍镜视野下有4-5个细胞即可。照着师兄的方法去做，但发现细胞长得很慢，一般要6-7天才可以传代一次。查阅了ESC培养的相关protocol，发现大多数认为传代比例不能大于1:10，3天左右传代一次。而师兄的方法传代比例远远大于1:10了（离心后的细胞稀释成2ml后往往只加上一滴 ）。师兄认为细胞长得慢不是传代密度小的原因，是因为血清浓度低（13%）（师兄不认为传代比例过大）。
, d/ g: `; l5 T# C0 `查阅了许多protocol，没有明确的说明传代后的接种密度，让我有点迷茫了。不知道是师兄的方法对呢，还是protocol不权威。询问几个相关问题：
( f& P, v) [7 [) n# o# W( ]" L9 Y4 f8 F1、mESC习性如何？是喜欢独处，还是不喜独处（喜密还是稀）？
9 k/ e7 r( T3 F6 \* W7 U2、mESC传代密度对其自我增殖及多能性维持有啥影响？合适的传代密度是多少？
% T6 p9 J' r- o) u3 Q3、mESC培养过程中如果出现分化的细胞集落，该如何处理？多次传达是否可以去除分化的细胞？
, [) e+ Z% t$ G. s4、传代消化时挑选状态好的单一集落进行传代接种，是否可以保证传代后细胞处于未分化状态？, r; S5 M8 w2 m
希望师兄、师姐多多指点，若能上传手头权威的protocol，将不甚感激！9 P8 C3 q" B, i* Y

9 j2 z- e( v) a5 G) A* P' l我先上传一个我手头的protocol
/ s) ^1 [" M* @, F2 y+ _7 N& O: d7 A

懵懂干细胞

我没有严格计算比例，大概应该在1：5、6吧，也就3天左右传代一次啊，6、7天的话我觉得是有点长，
6 `/ m+ {( o3 y$ {ES细胞培养过程中除了lif抑制其分化外还有就是细胞密度低一点也有效的抑制细胞分化，ES细胞克隆间的相互接触! d; h3 n9 w/ ^" @' B* X
作用也能促进细胞分化！所以传代还是稀一点好！

懵懂干细胞

% [* K* G7 j* |: K
这是我最早看到的中文文献！

conggu

谢谢楼主，我也想问这个问题好久了。。。

almasun97184

7天是有些久，太久了饲养层细胞都状态不好了，容易分化。/ c3 M8 M- _. o: H
我养mESC也是一般1：10，3－4天传代一次，细胞状态挺好的，基本没有分化。
) I+ ^  F! p4 a2 R* ~8 o6 s& _如果分化细胞多，最好挑选好的集落传代，或者减少消化时间。ESC容易消化而feeder以及分化细胞稍微难一点。3 @" h5 |6 O# v3 e, E/ ~* R
血清浓度一般都是20%。
. l# v# i) F6 |% g  t: B: m为什么你不按照标准操作规程，而要用不被广泛承认的操作方法？到时候写文章都不好写呀，后续试验的结果也不可信。

almasun97184

7天是有些久，太久了饲养层细胞都状态不好了，容易分化。
7 A  s- f( h! J6 w0 \5 \, r我养mESC也是一般1：10，3－4天传代一次，细胞状态挺好的，基本没有分化。
9 j' s# }. V$ O% J& y4 z" z如果分化细胞多，最好挑选好的集落传代，或者减少消化时间。ESC容易消化而feeder以及分化细胞稍微难一点。
* P- I# \0 i+ Y- _1 {. {# J2 [( [血清浓度一般都是20%。
8 J* Y# F; ^: b0 |/ v为什么你不按照标准操作规程，而要用不被广泛承认的操作方法？到时候写文章都不好写呀，后续试验的结果也不可信。

dilal

回复 almasun97184 的帖子; h+ L& J- S+ v& |! F+ J- g' j
6 G" ~2 s2 I; }5 Q3 n. `: T' P7 v
谢谢你的回复，未分化的细胞容易消化而分化的细胞不容易消化。请问一下你是在哪里看到这样的描述的，我一直在查找这个问题，都没有找到答案，而师兄跟我说的恰恰和你的相反。
' \: o4 O1 R+ f- i5 N/ [忘了说明了，我们采用的是无feeder的培养方法.

7ubo

dilal 发表于 2011-5-7 10:59
) ^- C* p8 L0 Q4 G6 J+ q回复 almasun97184 的帖子
- z$ a, l0 x3 ^1 v# V1 a3 H! @8 h+ C- {+ x$ j$ j7 r1 @- T
谢谢你的回复，未分化的细胞容易消化而分化的细胞不容易消化。请问一下你是在哪 ...

4 b) q/ U* K$ {5 b& Q无feeder的培养， 需要什么特殊处理？什么种类的干细胞都可以这么养吗？有什么弊端吗？

7ubo

almasun97184 发表于 2011-5-6 15:34
$ `" |, d( L7 w5 [) o# a+ _& p  `* \7天是有些久，太久了饲养层细胞都状态不好了，容易分化。; k& B* t; z8 b. }: \" P
我养mESC也是一般1：10，3－4天传代一次，细胞状 ...

- H( r2 @3 }. c8 d, q
“ESC容易消化而feeder以及分化细胞稍微难一点”
5 l! a/ a/ L* E& d  V! }消化之后可以用枪吹吗？

7ubo

ESC的克隆之间接触为什么会造成分化呢？必然造成分化吗？有没有这方面的理论研究？