关于mESC传代密度与其细胞状态维持的问题

dilal

ESC传代密度让人很纠结，养了半年细胞了也不是很清楚。师兄告诉我ESC可以传的稀一点，因为ESC自我增殖能力很强，单个细胞可以长成一个集落。从来没有细胞计数过，显微镜下目测低倍镜视野下有4-5个细胞即可。照着师兄的方法去做，但发现细胞长得很慢，一般要6-7天才可以传代一次。查阅了ESC培养的相关protocol，发现大多数认为传代比例不能大于1:10，3天左右传代一次。而师兄的方法传代比例远远大于1:10了（离心后的细胞稀释成2ml后往往只加上一滴 ）。师兄认为细胞长得慢不是传代密度小的原因，是因为血清浓度低（13%）（师兄不认为传代比例过大）。
0 r% s0 X: N$ [# X查阅了许多protocol，没有明确的说明传代后的接种密度，让我有点迷茫了。不知道是师兄的方法对呢，还是protocol不权威。询问几个相关问题：
8 t8 \; e- _- o# |+ y$ t1、mESC习性如何？是喜欢独处，还是不喜独处（喜密还是稀）？
7 J; C) F* y! r. `4 v2、mESC传代密度对其自我增殖及多能性维持有啥影响？合适的传代密度是多少？0 E" e# B( W1 Q! v" m7 {# M
3、mESC培养过程中如果出现分化的细胞集落，该如何处理？多次传达是否可以去除分化的细胞？1 c% v$ k) ^+ o3 `' c4 u
4、传代消化时挑选状态好的单一集落进行传代接种，是否可以保证传代后细胞处于未分化状态？4 L* F+ G& \+ V0 E! d1 Z2 `% Z# S
希望师兄、师姐多多指点，若能上传手头权威的protocol，将不甚感激！' H) W7 ?! e7 U* ?1 z- q  |. {

' g; M8 e1 {( B' Y我先上传一个我手头的protocol
4 I  y9 B' m* ?9 {' g" }6 f! H& I

懵懂干细胞

我没有严格计算比例，大概应该在1：5、6吧，也就3天左右传代一次啊，6、7天的话我觉得是有点长，' R( w, R9 k( G7 K& {& F
ES细胞培养过程中除了lif抑制其分化外还有就是细胞密度低一点也有效的抑制细胞分化，ES细胞克隆间的相互接触8 ?" ?3 z+ `7 v6 _; X1 j
作用也能促进细胞分化！所以传代还是稀一点好！

懵懂干细胞

. n( n$ e$ R: N
这是我最早看到的中文文献！

conggu

谢谢楼主，我也想问这个问题好久了。。。

almasun97184

7天是有些久，太久了饲养层细胞都状态不好了，容易分化。; E! U% f6 o; Q8 I: }# r
我养mESC也是一般1：10，3－4天传代一次，细胞状态挺好的，基本没有分化。" W; Q; k% L  F! W' |6 M5 e" U! N1 b
如果分化细胞多，最好挑选好的集落传代，或者减少消化时间。ESC容易消化而feeder以及分化细胞稍微难一点。
" \$ p8 q0 [4 Z3 i6 O- J* o9 U血清浓度一般都是20%。
7 ]) }0 l, T9 i3 C为什么你不按照标准操作规程，而要用不被广泛承认的操作方法？到时候写文章都不好写呀，后续试验的结果也不可信。

almasun97184

7天是有些久，太久了饲养层细胞都状态不好了，容易分化。2 v( x, B5 ~3 e2 S
我养mESC也是一般1：10，3－4天传代一次，细胞状态挺好的，基本没有分化。& c& `" l( ~/ ]# X0 g
如果分化细胞多，最好挑选好的集落传代，或者减少消化时间。ESC容易消化而feeder以及分化细胞稍微难一点。6 B! Q1 I/ [9 o& L- s
血清浓度一般都是20%。
& z, V  A% X) D* G' o为什么你不按照标准操作规程，而要用不被广泛承认的操作方法？到时候写文章都不好写呀，后续试验的结果也不可信。

dilal

回复 almasun97184 的帖子
3 N) I8 n* z5 o8 Z7 J! t9 o1 @% m* K8 h6 h; c
谢谢你的回复，未分化的细胞容易消化而分化的细胞不容易消化。请问一下你是在哪里看到这样的描述的，我一直在查找这个问题，都没有找到答案，而师兄跟我说的恰恰和你的相反。
! D: i) k- b2 ^+ Z8 @8 M忘了说明了，我们采用的是无feeder的培养方法.

7ubo

dilal 发表于 2011-5-7 10:59
9 G6 G( s* t* m, }( `0 Z回复 almasun97184 的帖子6 G0 i! e2 r: B7 ^! [/ E  m- o
( C0 W' b4 e5 {) u) c
谢谢你的回复，未分化的细胞容易消化而分化的细胞不容易消化。请问一下你是在哪 ...

; c* q. Y: v% |' j( Q  J+ r" j" j无feeder的培养， 需要什么特殊处理？什么种类的干细胞都可以这么养吗？有什么弊端吗？

7ubo

almasun97184 发表于 2011-5-6 15:34
: U' P; W9 \& h+ {" Q( @. J4 g7天是有些久，太久了饲养层细胞都状态不好了，容易分化。: \# r! Z" V; U8 Y$ N
我养mESC也是一般1：10，3－4天传代一次，细胞状 ...

8 x& f# r- z1 r# a) _$ t“ESC容易消化而feeder以及分化细胞稍微难一点”' r% M" z' ]8 H1 Y5 {7 Z% V
消化之后可以用枪吹吗？

7ubo

ESC的克隆之间接触为什么会造成分化呢？必然造成分化吗？有没有这方面的理论研究？