兔骨髓间充质干细胞的提取

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首先讲解一下处死兔子后取骨髓的方法# z' j! w& ~$ Q8 \- x: G2 n% f9 l
步骤如下：
- z& R9 y6 w( b! F; L+ m: D- ^& x, y一: 2周龄新西兰大耳白兔一只，空气栓塞处死，75%酒精浸泡10min（全部浸没）；
7 b# i/ A: _8 `6 m# c4 U5 A: G二: 带无菌手套，实验室空地方铺无菌巾一张，将兔子放在无菌巾上，用钳子，镊子，剪刀等分离出完整的股骨，胫骨，剔除骨表面的肌肉，表面组织尽量少为好，将分离好以后得骨放置在无菌的培养皿中，转移至超净工作台内（预先紫外照射30min）；
3 F- W+ c( ]+ U# |$ D+ n- @. p三: 准备三个无菌培养皿（我用的是9cm），每个中加入15mlPBS液，将骨分别依次在三个培养皿中清洗以除去骨表面碎屑组织；
7 J* b" u6 M( l- G4 x6 t4 D8 Z四: 用剪刀剪断股骨，胫骨骨的干骺端，两断都剪断，但不要剪的太多，尽量保留干骺端，能够冲洗，抽吸骨髓即可，然后用10ml注射器取无菌的PBS液10ml，冲洗骨髓至另外的无菌培养皿中，PBS液用量为20ml，反复冲洗，直到骨髓腔变白，干骺端也变白（我觉得骨髓间充质干细胞主要在干骺端）。始终保证总量为20ml，因为分装至15ml离心管中的时候不能太满，容易污染。$ G5 W9 I7 x  h0 R! Z" ]  s
五: 将收集的骨髓过滤，我的滤网为70um，购买自BD公司的（找的代理商买的，貌似16块钱一个，一次卖的是50个），过滤到无菌培养皿中，然后转移至两支15ml离心管中，离心，1500rbp，5min，弃上清，15%培养基（FBS 15ml，双抗1ml，低糖DMEM液85ml，FBS，DMEM液购自GIBCO）6ml重悬细胞，重悬的次数大概为100次（个人觉得次数多了可以将细胞冲散，有利于细胞的贴壁），然后分装至T25培养瓶中，两瓶，每瓶3ml，然后再每瓶加培养基2ml，一共5ml，做好标记，放置培养箱中培养。% G: p7 t! N- G! q& [
六: 5天以后第一次观察，期间不要换液，不要观察，一般好的培养基5天后可以见到部分细胞贴壁，此时全量换液，然后2~3天换液一次，基本上10天左右可以传代。- \: j* \  t5 U, n0 `
七: 同理取另外胫骨，股骨。
* Z; d1 [& N+ R0 V. I实验所需要准备的器材0 E# R7 y6 k0 F3 N5 `
一 超净工作台之外，5ml注射器一个，无菌巾一张，无菌手套一副，75%酒精若干，烧杯一个，Timer，消毒好的剪刀，镊子，钳子等分离的器材，9cm无菌的玻璃培养皿（推荐玻璃的，可以重复利用）一个；
) f( w* Y1 [- A8 Z4 ^6 b8 b! U; y( f二 超净工作台之内，10ml注射器若干，一次性手套一副，无菌培养皿5个，滤网一个，剪刀一把，镊子或钳子一把，15ml离心管4支，PBS液若干，培养基若干，培养瓶4个，吸管若干，记号笔一只。- ^) H5 ?8 Z% S0 D7 H3 L8 O- [8 Y
只记得这些了，要是忘记了大家可以补充的。

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. _* N) ^3 C4 n% Q; W* y2 m活体取兔骨髓间充质干细胞方法$ u3 v. S2 K/ b# R* `) h( y
我活体用的兔子是一个月大的，确切的说是28天的兔子，方法如下
4 Q( ?0 F- k5 s! [2 t; n    称重后麻醉，1%戊巴比妥钠，文献上面说3ml/kg，具体的就靠自己把握了，麻倒为止，备皮，剪掉胫骨，股骨处的兔毛，然后1%活力碘消毒消毒，铺洞巾；
  A2 j; m0 B% S0 B; V" C2 p    刀片划开一个小口 长约1cm，与胫骨中断处，然后穿刺针，或者电钻（我们用的是电钻）钻开一个小孔，反复抽吸骨髓，具体的量 实在不不好把握，能多抽点就多抽点吧，不要用PBS液冲洗，抽吸后用棉球堵住孔，再抽吸的时候再把棉球拿开，以免造成不必要的出血，抽吸的骨髓装在预先装有1ml（含有肝素3000-4000U）肝素的离心管中，不用肝素也可以，但是速度要快，个人觉得还是用肝素的好，过滤，离心，跟上面的步骤一样的了。

林达

呵呵，学到了，很厉害哦，大侠们现在培养细胞已经是如火纯清的阶段了吧。。。可以教教我吗，我取了3次了，每次都失败，好烦哦，没有细胞源，做不了实验。。。

xiao6tao

我觉得如果很熟练的话就直接处死小兔。如果动作很慢的话，或者方法技巧不到位的话，建议麻醉。因为处死后，在慢慢提肉，会影响以后细胞的干性

林达

那个，用筛网过滤这个步骤是必须的吗请问，可不可以改用纱布过滤啊，我们实验室的筛网已经锈穿了。。。或者，可不可以省去过滤这个步骤啊，请问过滤的目的是什么啊，各位大侠，谢谢解答，辛苦咯

267318024

回复 林达 的帖子9 u1 G3 b/ e' B9 N$ `

5 N# s5 R4 `7 A4 b. w3 O& A因为收集到的骨髓是成团的，过滤的目的是为了使其成为单个的细胞，要是不想过滤的话也可以，离心后多重悬一下，应该也是可以达到目的的。