测序结果

鹤顶宏

华大回复：您的样品杜INH_1两端引物的测序结果均为非单克隆。
  z. ~0 U3 [! P+ h请问非单克隆是什么意思呢？3 k4 W! g$ y5 I& F# Z8 f4 ^
根据网上公布INH全序列设计引物后，我的扩增条带比预计多2k，测序结果显示内含子上插入2k片段，这是怎么回事？

wwy551

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) d6 D/ G! |$ A9 v
# W9 L: ?0 W  N; G0 ?2 G& S: W测序结果非单克隆就是说明你送测序的样品不单一，如果是质粒的话就说明里面混进了除你想测序的别的质粒，如果是菌液的话就说明里面有杂菌。
8 t& `+ o7 I& L4 e( Z建议你跑电泳回收正确大小的片段，重新转化，涂板，挑菌小摇后送测序。

chineselangzi

非单克隆，可能是你挑了两个菌。
# m0 @# f9 \6 L9 N% B9 [6 s5 r从测序结果分析，可能是构建载体时酶切位点设计有问题。8 C/ a8 ]3 _5 t$ B2 L

( X4 z5 C& E8 s, K" j7 `) S7 V“根据网上公布INH全序列设计引物后，我的扩增条带比预计多2k”这个我在想：如果你是用质粒做模板，可能PCR出你的目的片段以外的部分（整个质粒，除了你目的片段外的）。
* b6 X; o/ P" |) A这个你可以变化一下退火温度，PCR出你的目的片段。

鹤顶宏

回复 chineselangzi 的帖子" I; h/ R7 r; B  i' b0 ^  K
( F  x8 W: W9 q- G& k" S( V
我用的是pmd-18T载体，如果说是扩增目的片段以外的片段为何会处于目的片段中间，而且多于的片段位于内含子区域，测序结果显示存在重复序列。如果我用cDNA为模板扩增，得到的结果和网上的完全一样。

chineselangzi

我不知道你要构建的是什么，一般我们都是从cDNA扩增基因的ORF部分就OK了---用于该基因的研究经常是这样，因为只有这些翻译蛋白，你说的是针对基因组DNA设计的引物，当然会扩增出含内含子的部分。你和该基因的全基因序列比对。你是不是没有搞清基因组和cDNA的含义。不过我这样理解的话你的结果是对的。
8 }0 a& t) w3 S! n! d7 h顺便说一下：英俊的测序比华大的更稳定一点---只属个人意见，仅供参考。

鹤顶宏

回复 chineselangzi 的帖子1 h+ c, e; Z3 v( y: ]' L- n

0 y- @0 F0 ~0 |8 R" U) N3 Q网上公布的内含子大小为996bp，而我的结果除了两段外显子外，在内含子内部还多出来1800bp的序列

chliu

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9 C: f$ v) _$ X8 t
' n0 _5 A6 Z1 z9 T' j/ e你用于扩增的品系与网上公布的序列的品系是相同的么？很可能是你的品系的序列事实上就是内含子里多出来1800bp的序列，但是内含子多出来的序列不会影响其表达的mRNA的序列。

chliu

回复 鹤顶宏 的帖子9 z* Z# ]4 J; L, C. L5 Z

0 t3 Q3 ~, w8 t8 E2 s1 amRNA只是DNA剪切后留下的外显子的部分，所以内含子序列不同不会影响mRNA的序列，cDNA是由mRNA反转过来的，所以cDNA的序列也是相同的

鹤顶宏

回复 chliu 的帖子) X- ?5 `4 e% t) M2 _% G' p( G
5 l; [4 R' s  D2 R5 q8 `4 ~
网上公布参考文献和我的都是一样的，为杜洛克猪。文献中说是996bp的内含子。我是用来构建敲除载体的，应该内含子部分对我的实验还是比较重要的

绿雪

回复 chliu 的帖子2 E+ f. @* W# O) l

2 P! v& b; I* y) B' L1 k其实内含子也是有功能的。