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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-6-7 23:35 编辑 ! q1 K# j+ N. w' }
5 a& \7 m8 U* @0 a
刚看到一个人发的贴（满病毒载体构建原理），感觉不是很齐全，慢病毒载体构建原理，你百度一下，百度会告诉你，在此补充一下其它方面比较实际一点的东西
) c Z& d3 g/ ]2 a: g2 G/ `" c/ ?# X包括293T细胞培养，慢病毒载体构建，滴度测定等
; w2 q h. V& z% O# `一、目的
6 E3 ~& G/ L! M采用慢病毒转染293T细胞的方法对目的基因慢病毒载体进行包装并对慢病/ r0 U% h E0 }5 M, U
进行滴度测定。* S2 B) {. \8 I( q5 v8 F: p: \
二、材料3 A- G4 I9 V) {9 \, j+ N% J- T* h
细胞株:293T
9 [2 j, e5 \ |: B1 O菌株:大肠杆菌菌株DH5α
5 p, `) o, }& \2 `9 T5 q3 m病毒载体:（a)pGC-LV重组载体；（b)pHelper 1.0；（c)pHelper 2.0; K4 R+ J0 _- \6 C6 O! d
DNA溶液的制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种2 m6 k8 A1 j9 u. v
质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证+ E/ `: X- b# c, V4 E% K
所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。2 Z; N% t/ x" {/ T( q8 \
1.主要试剂( a, C5 l1 i% a2 g
台盼兰 美国Sigma公司
2 `$ w9 y+ ]& ~: ]* w9 v 胎牛血清 美国Hyclone公司
/ Z5 W6 ^9 H+ Q7 D, t% L0 a8 Z DMSO 上海生物试剂厂9 T4 ~3 w0 }; G. h2 f7 g4 w
DMEM 美国Hyclone公司
$ J% T* `# V0 v0 b! T1 t 胰蛋白酶酶 美国Gibco公司1 k/ I O4 s- T2 N E
Lipofectamine 2000 Invitrogen8 |; F' i. p# K
2.主要仪器7 B0 T% \ k z* K2 w) D# m$ T
荧光显微镜 奥林帕斯
. x1 V& e3 s5 R$ I# ? CO2培养箱 上海力康
0 J6 L5 J9 i4 p5 G3 O 生物安全柜 北京东联
0 A, b, s9 H/ C: JPlus-20离心超滤装置MILLIPORE
5 `2 ~1 _1 W5 J7 z* ]$ p三、方法2 J9 g& i' S" i* b/ j3 b. J
（一）293T细胞的培养1 h1 X8 W: i' L3 m, h2 L/ y8 ?) G
1.293T细胞计数
! t% V' B# K# y& M; ~/ N 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml,在0.1ml的细胞悬液
" c/ B. N) {: }- y& O7 J中加入0.1 ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数
4 R1 Q# g) {- q6 D细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
. {) Q- M# h3 W: g4 J& G1 f8 y( Y5 z# y
2.293T细胞冻存) t3 m# h! r3 @( o1 V) ~. r* n
（1)取培养2～3d生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106-2×107/ml
$ O6 ]- D: @" r# X7 j5 D1 h, V（2)在1 ml细胞冻存管中加入0.5 ml细胞悬液，0.4 mlFBS和0.1 mlDMSO，混' ^' \% U- V& U; r3 F
匀后密封。置4℃10min，-20℃30min，然后直接放入-70℃保存。
9 g: }1 A/ L4 n6 r/ W' n9 H1 B7 ?8 c
3.293T细胞复苏( w6 [ f8 k4 }) S) D* V5 i
（1)从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。
K) c: s; S' ]( K9 ]4 j3 I（2)迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。
% J5 {) ^8 F/ }- e+ r! R0 M（3)用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml
" j2 u: n e2 A- A# @2 g8 U0 f含10%FBS的DMEM培养基，置温箱培养。
8 q- K% O" Q! T9 C" w（4)次日更换一次培养液后再继续培养。
. _2 u Y4 u9 |) t7 `, _( j1 W' o; x' M% |3 L5 Q& W1 a
4.293T细胞传代& e& E" f' T8 z: O; l
（1)弃去旧培养液，加入5 ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然
% B- d8 H7 Z R( E后弃去PBS溶液。; U0 k& i$ ^& U, _
（2)加入2 ml胰酶消化液，消化1-2 min直到细胞完全消化下来。8 p7 k- g2 f" h# |# `$ f
（3)加入含10%FBS和100 U/ml双抗的DMEM培养基5 ml，用刻度吸管吹打数次，9 P; u1 t a% c: E
将瓶壁上的细胞冲洗下来。; }5 G7 N) u" |6 k0 i
（4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。) B# _1 i0 x- w7 p/ \% R. ?
$ s0 P& W: Z% W8 {4 d$ \
（二）慢病毒包装
( ]4 P) G1 ^4 r% m: l+ b5 q0 @$ ~1.293T细胞转染# ~7 L& c! g5 S! L6 I2 t" @
（1)转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%FBS的培养基
! e2 W5 e3 n- g; i- h调整细胞密度为1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于15 cm细胞培养皿37℃、5％CO2培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。- B; Y4 e& t3 O% e) d% k7 g
( e. B& G" w+ B/ M
（1)转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。
- ? H, d9 Z. H* ~6 E R4 Z% `（2)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5min。" g. R+ K. q6 D! w' r$ C
（3)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100ul Lipofectamine 2000试剂
/ c, H' s# Z: V) N6 c; w在另一管中与2ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min。
: F9 H( D' \2 B% _, b! |; n6 @3 [（4)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混
; T: R8 ^' O( v: r+ i: I匀，不要振荡。必须在5min之内混合。
. k7 @0 x! z, G, ^$ j: {7 W0 y（5)混合后，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液
( [8 O5 j% b6 S; ]# E' p3 g的转染复合物。
: A" h/ U* @! o8 q& C, I" u（6)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，
~9 `& h5 u8 E* Q- v0 X2 D3 J. T于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。
* r J+ i4 ?0 o4 q（7)培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，; V) c9 }( }' v! X* p2 |
轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
" h6 s) V: V. y" @（8)每瓶细胞中加入含10%FBS的细胞培养基25 ml，于37℃、5%CO2培养箱内
; l) K! W4 B1 {. }% G; E5 K6 A3 r% T% f继续培养48h。5 r6 d, h3 N8 Z1 K; A7 O7 w
* o& ]1 D8 k$ \- y. r7 d# e2.病毒的收获及浓缩( s) \5 I& i% s
（1)收集转染后48h（转染即可为0h计起）的293T细胞上清液。
1 y' b/ ~% z6 X9 X& \. |5 s5 W（2)于4℃，4000g离心10 min，除去细胞碎片。
. x9 ~/ b3 [9 D! h1 X. y5 n（3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。
: H& E( J# w8 P1 Q, V: i（4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子。将过滤杯插; o- S( a) k. X w8 a
到滤过液收集管中。 g. g4 [& h' X# H+ f6 _/ r
（5)组合好后，做好平衡，放在转头上。
/ D2 d% H9 M" `9 ], b（6)在4000g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15min。) o& i Z8 Z2 l: i2 d2 S! q0 i
（7)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。
9 \5 {( `0 k F1 @: l" p（8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上。1 ~ \5 J# Y, X, r! Q
（9)离心力不超过1000g,时间为2min。过高转速会导致样品损失。把离心杯从
1 Y3 _6 Q8 x! Q( X4 C1 ?; n样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。
6 Y# J p! \" x& [1 a8 g& W（10)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-70℃长期保存。取其中一支3 b3 @: h7 A0 Z, r& ^. L/ @
进行病毒生物学滴度测定。
( |6 H$ V% {2 N
2 `2 k. a' T( i' M0 o3.慢病毒滴度测定9 L# t8 v$ v/ G5 R1 ]( y
孔稀释法测定滴度
6 }: n* K9 T& _7 G+ w) x& F( `5 L（1)测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，96孔板，每个孔加4×104# q3 q/ z' r& x& ?
个细胞，体积为100μl。
- k) K; ]' w# {. w* B( q+ ]5 p8 Y（2)根据病毒的预期滴度，准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl" c. v8 L! J4 F9 C; G2 h, i
无血清培养基。" k7 P8 ?/ c0 e; w$ e' y
（3)取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入
( o& z3 D4 u2 S; y% n到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。1 q) A) ^1 K. b. S
（4)选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒
% J7 D5 l; J& L& s! G溶液。放入培养箱培养。6 w. A+ g$ q7 A6 V
（5)24 h后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。% X0 R. u4 x0 h
（6)4d后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。
. k9 E: Y& K* ^/ j说明：
1 L6 O" t2 h4 Y* l5 }第一个Ep管中加入10ul病毒原液，记为1E+1μl；) m3 a) [; Z- Q* M1 [9 ^, T. L
第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0μl；, n0 C* F# }% X+ E" S
第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1μl；
8 ]" B5 T3 R) v$ @, w. i+ n Y依次类推…
3 I* a* G5 g) E% P第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5μl；" `+ B: \4 N2 q. m: a9 c
第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6μl；, t: @; y, _. N. K( x9 z
% B0 @7 T; V5 \四、结果
! ~" w; Y7 a! H5 y1 {2 p. Y( h1 n
慢病毒滴度计算:/ l0 F9 h% v# h9 m1 f1 p
根据荧光图片中GFP表达情况，在加入1E-6μl病毒原液的孔中观察到2个
& g8 |: Q$ Z( |" r6 ~带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度8 S& h$ \3 x" J' P5 {; d. u) _9 k
等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，即2/（1E-6）=2E+6，单位为TU/μl,
, ^/ \: ^$ G! D& ^也就等于2E+9TU/ml。按照此方法对四种目的基因慢病毒载体进行滴度测定，结
" B2 M( f' ~4 {( N果如下：
8 n3 ?8 t8 \$ Y) X$ MOct4–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml- L( ~" {7 H& Y9 T
Sox2–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml0 q4 H* Z* L3 c: E7 L
c-Myc–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml
8 z1 E/ t5 F: UKlf4–慢病毒载体滴度:2E+9TU/ml |
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发表于 2011-6-7 21:19
