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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-6-7 23:35 编辑
7 U3 p; e0 o, M. R, E
1 m. ?' c* w7 {3 @刚看到一个人发的贴（满病毒载体构建原理），感觉不是很齐全，慢病毒载体构建原理，你百度一下，百度会告诉你，在此补充一下其它方面比较实际一点的东西) v9 Y5 v- k" r) K# u# i: N
包括293T细胞培养，慢病毒载体构建，滴度测定等
' Q) H! {/ p8 Y' A+ y一、目的* K/ [) P$ m' X) S1 l+ i
采用慢病毒转染293T细胞的方法对目的基因慢病毒载体进行包装并对慢病
8 F; W7 Q- e1 b: z进行滴度测定。7 H. |; Z) `( |2 H: U
二、材料, v+ [6 |# q0 C2 t
细胞株:293T
/ H' c! I, b& q# D% C菌株:大肠杆菌菌株DH5α8 s. u, f5 p, Y
病毒载体:（a)pGC-LV重组载体；（b)pHelper 1.0；（c)pHelper 2.0 S+ z M( g1 E
DNA溶液的制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种& b: E5 {" Y1 n$ u# K2 f6 ~6 l/ I
质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证3 i9 v- U- n- x6 l2 O
所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。
/ `& G( Y- ^5 ^3 \4 K1.主要试剂
( ^0 v7 B4 \3 ^& m# e$ } l 台盼兰 美国Sigma公司2 B" ] S8 W- }% G5 {8 M
胎牛血清 美国Hyclone公司
8 O6 a* `* l9 M DMSO 上海生物试剂厂! T7 ]6 d o1 C, j" c" G0 H* m2 q
DMEM 美国Hyclone公司
4 H4 M/ b/ K" ` I p 胰蛋白酶酶 美国Gibco公司# a! ]; s: l* _% A H
Lipofectamine 2000 Invitrogen
9 s5 U, g; D, d/ W* u9 `8 F( V2.主要仪器
7 a4 P( ?! l, z- r z 荧光显微镜 奥林帕斯
4 V+ X4 d* K9 b; u CO2培养箱 上海力康
0 y3 X6 w3 ~% d1 c$ r" c" O 生物安全柜 北京东联
" K- U* A9 V5 t& |# {Plus-20离心超滤装置MILLIPORE
0 m$ g& f h) r" C5 Q三、方法9 F7 _: w2 B2 D' k) Y7 ~ w" O5 g
（一）293T细胞的培养
9 }6 v! A7 x& ?) F+ i& q$ w1.293T细胞计数
. K; p$ [9 P/ {% R2 z1 J 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml,在0.1ml的细胞悬液
/ g' k+ C- [: h0 ]1 ~* L/ B中加入0.1 ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数
/ V: U2 ]$ \. U2 ?9 F. h- L细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。4 m: s) C7 q' b+ H3 k2 ?9 @# R( p
8 x2 A- d* V! k% c( V, q) z# E) f2.293T细胞冻存- |8 r" d0 W Q
（1)取培养2～3d生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106-2×107/ml
/ {3 |) M' t) O3 O1 T（2)在1 ml细胞冻存管中加入0.5 ml细胞悬液，0.4 mlFBS和0.1 mlDMSO，混
" n# d6 A- ~) S) m% C" |匀后密封。置4℃10min，-20℃30min，然后直接放入-70℃保存。! s" T# N" T E* q; b
; D# n' U% M2 \% S6 o, }
3.293T细胞复苏/ o+ L+ H2 u9 }! e& b& P8 y
（1)从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。& C7 S3 O& i/ ^* h* ^5 g+ u, @; ?
（2)迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。
7 D) P* G# V4 L（3)用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml
" Y$ ^2 a+ G+ `% m含10%FBS的DMEM培养基，置温箱培养。
- O# \+ m1 N- Z3 s9 M- k（4)次日更换一次培养液后再继续培养。
2 W& P: d! y% K4 i! Q# }5 @9 p. O6 R3 t
4.293T细胞传代+ d# i& r4 e6 f. @0 F4 V, Z
（1)弃去旧培养液，加入5 ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然
- x9 @ M' L$ t后弃去PBS溶液。
( s) q! d0 \0 I! m% N（2)加入2 ml胰酶消化液，消化1-2 min直到细胞完全消化下来。
1 O1 O/ A, a" }9 S+ d（3)加入含10%FBS和100 U/ml双抗的DMEM培养基5 ml，用刻度吸管吹打数次，
8 v' ]$ W5 G2 k! m! j: ~3 r将瓶壁上的细胞冲洗下来。
9 b4 E# W k" J8 d（4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。9 T4 A" t% x6 H. c
& N2 V. [$ o( T5 ^, g) y
（二）慢病毒包装
9 o! W) z# w. ~' L& v1.293T细胞转染, ~0 F& n8 o' a! b" p r b' J, Z
（1)转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%FBS的培养基; ~3 Y) B% ~7 i" C- |7 t
调整细胞密度为1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于15 cm细胞培养皿37℃、5％CO2培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。
- S+ v' V2 u) C: I4 B% U, Y- }2 d2 A3 q3 w
（1)转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。) Y! G' y6 X# I- w) P" T0 t
（2)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5min。6 G- U- x& Z8 Z6 J# ], q. N' [
（3)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100ul Lipofectamine 2000试剂* F1 O1 G0 q1 n) Z* q1 g1 Q
在另一管中与2ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min。* z+ G" J! }/ N) J7 n
（4)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混
) d8 |0 ~1 K6 n& Q, j" v匀，不要振荡。必须在5min之内混合。4 i& Q, q4 u8 G ] b) b
（5)混合后，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液) C9 H/ j* w6 u! F
的转染复合物。
/ y8 @ I' v+ Y5 C- e! L a9 W（6)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，
- r+ z9 b7 D4 e& Q: p于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。
# N5 W/ A$ L0 o: D4 S（7)培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，. M/ j* I ?. _$ D" b
轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
3 f& A0 k8 d, i! A9 g（8)每瓶细胞中加入含10%FBS的细胞培养基25 ml，于37℃、5%CO2培养箱内! K- q# k, \7 ^7 a; s
继续培养48h。
( L& X5 Q, Q5 o+ w+ U K) n# t7 `, W
2.病毒的收获及浓缩
6 t. h0 [& k3 i( {( z n（1)收集转染后48h（转染即可为0h计起）的293T细胞上清液。
# ?" G8 |4 M5 o' _（2)于4℃，4000g离心10 min，除去细胞碎片。% M4 O1 N% Y' k1 j
（3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。
0 G1 e! C9 @& Q（4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子。将过滤杯插) R' Y( J% Y, H* N/ q
到滤过液收集管中。* g# [1 N- C0 a4 b- j- t
（5)组合好后，做好平衡，放在转头上。! R; F: M0 C! _( I
（6)在4000g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15min。
4 l; h" m% h4 N# a# _6 G' R（7)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。8 W% M+ d0 _8 x% T+ v
（8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上。# P* d& K9 z8 H. z5 e3 Z2 g
（9)离心力不超过1000g,时间为2min。过高转速会导致样品损失。把离心杯从
% ]- m- ~+ W. e5 L5 c' q样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。
, c! a! ^! T) _7 [/ b（10)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-70℃长期保存。取其中一支+ P& s4 w. G5 p2 s
进行病毒生物学滴度测定。. N9 e% v: [0 _0 w p* j6 [3 P1 H
2 ]3 O( W' W9 T3 l9 j* V% `+ k) K3.慢病毒滴度测定+ _$ q I: o: D0 f2 m1 K+ a' N2 o
孔稀释法测定滴度4 H% c: u) L1 t- q4 k, E* Y5 e
（1)测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，96孔板，每个孔加4×104' e Q+ L& _6 e
个细胞，体积为100μl。# L2 f+ K: {3 J( Y) n9 ?- q! ` ~
（2)根据病毒的预期滴度，准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl% G$ G; B5 l: N O
无血清培养基。2 X1 U9 B5 _- D& t
（3)取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入
+ V7 P" p) v1 z5 y! b% E1 ^- Q# b到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。
X* B1 n9 U# |8 f3 q: _（4)选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒4 r! w6 z8 G4 N ?
溶液。放入培养箱培养。
- g3 d2 @0 t: ~4 ~! c（5)24 h后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。
( c# r4 f) o' ^7 i# @（6)4d后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。 n9 W+ Q! n( g- f) p5 h: T
说明：4 V$ r" o& J8 k) | ?5 n1 u
第一个Ep管中加入10ul病毒原液，记为1E+1μl；' v/ U* g! |0 ?: d; Z1 q
第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0μl；
3 X# w; G2 ?8 t; O" {第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1μl；
" Y, H) g( H# H4 c. y! y依次类推…
7 ~2 @( i1 I9 R4 S0 K第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5μl；0 T* N7 S; k* c% P; m
第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6μl；
( A( n& J& F2 c2 k+ Y! x8 E
& |6 A0 z% a. z1 q四、结果! a0 X# A3 t3 ?7 S/ }* u
& H" e% q; u) e) ~7 i) X v慢病毒滴度计算:; ]& _% d% [. c* k4 t
根据荧光图片中GFP表达情况，在加入1E-6μl病毒原液的孔中观察到2个9 y; z/ n" L5 Q$ I w" E5 H0 p
带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度+ G. u7 n" i( A# J8 Z; ~
等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，即2/（1E-6）=2E+6，单位为TU/μl,
) B, ?, N: d+ E- s' j" {也就等于2E+9TU/ml。按照此方法对四种目的基因慢病毒载体进行滴度测定，结
3 o! F# q3 `' `; ^; r! n果如下：
" B) X) G0 @; e% rOct4–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml6 `! Y' ^1 Z, |" g2 s
Sox2–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml- L* e( d9 F1 x' {3 _! i
c-Myc–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml' F+ `0 S$ Y- _% Q
Klf4–慢病毒载体滴度:2E+9TU/ml |
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发表于 2011-6-7 21:19
