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本帖最后由 细胞海洋 于 2011-6-7 23:35 编辑
2 q+ z/ C' w3 n% O! ^/ x8 X
+ ]8 k% H- y2 d5 y& L9 U刚看到一个人发的贴（满病毒载体构建原理），感觉不是很齐全，慢病毒载体构建原理，你百度一下，百度会告诉你，在此补充一下其它方面比较实际一点的东西8 s, _6 S" M6 N4 n# e& F
包括293T细胞培养，慢病毒载体构建，滴度测定等
- C9 u% y& p2 @7 j6 N一、目的! u) `3 Q: m7 g! [$ J9 z
采用慢病毒转染293T细胞的方法对目的基因慢病毒载体进行包装并对慢病
( a+ s% Q. ` n* q( z, g' Y进行滴度测定。
9 X* Y, E7 Y0 o6 C+ V二、材料
, y' r' t) O. |1 [4 i0 O细胞株:293T
5 v+ A6 q2 o2 @! ]菌株:大肠杆菌菌株DH5α
0 a0 o2 _% C8 G; `# M4 E) y病毒载体:（a)pGC-LV重组载体；（b)pHelper 1.0；（c)pHelper 2.01 y+ T* w; l; Z) o! X
DNA溶液的制备：以Qiagen公司的质粒抽提试剂盒提取慢病毒包装系统中三种& B8 P& l8 }" ]. p0 P6 e3 i
质粒DNA，质粒DNA溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证( @1 s0 M8 G" I9 e# l
所提质粒DNA的A260/A280在1.8～2.0之间。4 O0 a4 J$ s$ b; N0 c& ~
1.主要试剂
( K. \' X M3 P7 g C e 台盼兰 美国Sigma公司4 I' P# _! n# _8 B& Y. `
胎牛血清 美国Hyclone公司2 W |% h4 M5 t1 v% a
DMSO 上海生物试剂厂
6 ^( ~) @* n1 N# ^& D DMEM 美国Hyclone公司0 |4 h- K7 K8 t/ x6 T( }, G# d
胰蛋白酶酶 美国Gibco公司
D: E) i2 `" c Lipofectamine 2000 Invitrogen( m0 g4 o) @6 J
2.主要仪器
$ E0 n( {% N1 ~- z4 G. Y 荧光显微镜 奥林帕斯
* T$ p% b- {6 j CO2培养箱 上海力康3 K* q( Z6 v# \% F
生物安全柜 北京东联
' \: Q4 U0 s( q/ l$ [9 }Plus-20离心超滤装置MILLIPORE9 c8 I3 W) o% `8 k- a/ ^
三、方法# b" G( h4 L& E9 T4 }
（一）293T细胞的培养2 f! s0 q) X$ d0 {9 N
1.293T细胞计数
. E) o7 R6 ?0 \; P# B6 \7 i9 y, N+ ^' p3 X 用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/ml,在0.1ml的细胞悬液
- R" O/ j7 P0 j: ~. t6 U中加入0.1 ml的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数
5 m i7 @4 V& r6 c细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。
6 r' |- D5 R: V
" ~+ A2 D) I8 B7 s% I7 P2.293T细胞冻存4 R/ \' I' s& v9 i m
（1)取培养2～3d生长旺盛的细胞，用细胞培养液将细胞配成2×106-2×107/ml6 q4 V7 l& s9 G+ i {* s: |
（2)在1 ml细胞冻存管中加入0.5 ml细胞悬液，0.4 mlFBS和0.1 mlDMSO，混 n, q, K/ r6 o! w' D; j) X! a; N
匀后密封。置4℃10min，-20℃30min，然后直接放入-70℃保存。
4 C8 J: ^/ Q' r7 j; [+ z
0 ? m5 G6 H- _$ U7 f/ {9 x8 d3.293T细胞复苏
* l) c2 I- R. ~) M2 N' m- f5 \% f. a（1)从液氮罐中取出细胞冻存管，应带有防护眼睛和手套。
6 k) i$ ^; [0 K* j) U（2)迅速放入盛有37℃水的水浴中，并不时摇动，尽快解冻。5 w' a% v1 b( Q8 A& T' g( c
（3)用70%酒精擦拭消毒后，移至净化台上，吸出细胞悬液至培养瓶中，补加3ml
; q. h* X8 d" `: a) W5 Z n含10%FBS的DMEM培养基，置温箱培养。9 C- |) Z- ~" K
（4)次日更换一次培养液后再继续培养。$ }+ v* }' Y6 D1 V, Q* N! h
0 d% ?0 ?# T8 L& H$ I4.293T细胞传代
6 j [# V7 |8 p4 |6 F% F: t- _（1)弃去旧培养液，加入5 ml灭菌PBS溶液，轻轻晃动，洗涤细胞生长面，然
6 w+ x+ U: d4 T后弃去PBS溶液。
+ c" b7 |/ L+ }9 j; t8 X5 b（2)加入2 ml胰酶消化液，消化1-2 min直到细胞完全消化下来。
; ]2 L# ^) E }$ Z) p2 Q* H1 m8 H, V（3)加入含10%FBS和100 U/ml双抗的DMEM培养基5 ml，用刻度吸管吹打数次，! B: A# Y3 U) E& b
将瓶壁上的细胞冲洗下来。
, B$ w$ [, @0 O; m8 G3 C! A3 |（4)混匀细胞后分至两个新的培养瓶中，继续培养。4 Q' q# J5 ~% v1 Y: S" Y4 [
( X$ K( H/ E, B, b) s( Q) Y（二）慢病毒包装+ G; j) y( [, M, s
1.293T细胞转染8 |* ~0 h# D) }7 u
（1)转染前24 h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞，以含10%FBS的培养基- b6 E) _6 {. _3 d
调整细胞密度为1.2 x 107细胞/20 ml，重新接种于15 cm细胞培养皿37℃、5％CO2培养箱内培养。24 h待细胞密度达70%～80%时即可用于转染。! n& a6 p/ g' B, ]# s
* L9 F5 T8 T* u% n, `0 y- J2 t
（1)转染前2 h将细胞培养基更换为无血清培养基。6 u; s2 E4 C( {$ O; a' t" J
（2)向一灭菌离心管中加入所制备的各DNA溶液(pGC-LV载体20μg，pHelper 1.0载体15μg，pHelper 2.0载体10μg)，与相应体积的Opti-MEM混合均匀，调整总体积为2.5 ml，在室温下温育5min。) x0 i7 I$ N+ d% p8 e
（3)将Lipofectamine 2000试剂轻柔摇匀，取100ul Lipofectamine 2000试剂8 ?/ e; m D2 |
在另一管中与2ml Opti-MEM混合，在室温下温育5min。
* o) ?$ q2 z2 B, B- q: w（4)把稀释后的DNA与稀释后的Lipofectamine 2000进行混合，轻轻地颠倒混
5 @# X' B, x: o" I# ?. r8 m匀，不要振荡。必须在5min之内混合。
6 N5 Y7 `# Y3 {$ m% y* A（5)混合后，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液& X( S: ?& P: p; D! w
的转染复合物。& \- Q) O( C% u" q( W
（6)将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293T细胞的培养液中，混匀，. o' n/ [1 o! w9 N
于37℃,5%CO2细胞培养箱中培养。: I5 T; S, P4 R
（7)培养8 h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入20 ml的PBS液，$ J* G! W/ e+ v9 W! I
轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去。
5 b9 w2 ?& }. r$ @% ~（8)每瓶细胞中加入含10%FBS的细胞培养基25 ml，于37℃、5%CO2培养箱内
* T) G$ e5 o% Z' b继续培养48h。
4 G$ @: ~9 `5 d5 [8 h4 b
\4 E9 z n9 k3 p+ X: u2.病毒的收获及浓缩
8 I/ o4 Q- e# I$ Z/ s( y# W（1)收集转染后48h（转染即可为0h计起）的293T细胞上清液。1 I u. x3 q) U* j, e* K
（2)于4℃，4000g离心10 min，除去细胞碎片。
5 D0 g( u O* ]6 `: R( g0 G( e2 S（3)以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中。
J! C& ^+ E3 F; W9 s（4)把病毒粗提液样品加入到过滤杯中（最多19 ml），盖上盖子。将过滤杯插
, b3 Q9 I+ A% d i3 O到滤过液收集管中。
|) l0 m4 n0 L（5)组合好后，做好平衡，放在转头上。( { v! Y: G1 q0 J6 ]- @. t( g# k
（6)在4000g离心，至需要的病毒浓缩体积。通常需要的时间为10-15min。" D) N- ?' K2 Y$ O
（7)离心结束后，取出离心装置，将过滤杯和下面的滤过液收集杯分开。+ F( c1 |, F% q: _
（8)将过滤杯倒扣在样品收集杯上。# o( B' O9 |$ y2 C2 f4 [
（9)离心力不超过1000g,时间为2min。过高转速会导致样品损失。把离心杯从% H( Q' {/ g8 a- N& N B+ E: A& m9 s
样品收集杯上移开。样品收集杯中的即为病毒浓缩液。3 a8 j; r6 j) r' b4 s+ ~
（10)将病毒浓缩液移出，分装后保存在病毒管中，-70℃长期保存。取其中一支
& E4 Q2 j# ?2 ?0 {) H进行病毒生物学滴度测定。! K: E# d3 |' ] C5 L: {1 p: a
9 c1 \) v: g8 L6 }3.慢病毒滴度测定
2 V( ?; {8 `: u1 g. [! d$ U孔稀释法测定滴度& [3 u6 c+ ~7 f; \: }
（1)测定前一天，为测定滴度所需的293T细胞铺板，96孔板，每个孔加4×1043 c% E x( x R
个细胞，体积为100μl。( Q. j1 |7 C8 ?$ N! z
（2)根据病毒的预期滴度，准备7~10个无菌的Ep管。在每个管中加入90μl1 @( g8 B" b4 ~. L; I6 r6 E
无血清培养基。
1 {: W0 u! V( ~2 _# ^) F7 ^- z（3)取待测定的病毒原液10μl加入到第一个管中，混匀后，取10μl加入5 n# ?4 O; x% `- K
到第二个管中。继续相同的操作直到最后一管。. |- y3 \3 U1 x
（4)选取所需的细胞孔，吸去90μl培养基，丢弃。加入90μl稀释好的病毒
/ Q& j1 i$ E& C4 f n3 Q7 Y7 T溶液。放入培养箱培养。6 z4 G5 T7 x* g: m8 F) z8 l
（5)24 h后，加入完全培养基100μl。小心操作，不要吹起细胞。; p6 { F3 T) _' c
（6)4d后，观察荧光表达情况。荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。7 ?! G# ?) B$ L$ o& [
说明：
1 \7 m! B" M. c4 n) N! a第一个Ep管中加入10ul病毒原液，记为1E+1μl；8 c7 u0 @# J7 ~
第二个Ep管中进行了第一次十倍稀释，所得病毒原液为第一个Ep中的1/10，记为1E+0μl；# l% Y+ N# z* \0 q$ h, H
第三个Ep管中进行了第二次十倍稀释，所得病毒原液为第二个Ep中的1/10，记为1E-1μl；, Q& i- Q& i7 {( ^
依次类推…( [6 R/ I# m* p# v7 b
第七个Ep管中进行了第六次十倍稀释，所得病毒原液为第六个Ep中的1/10，记为1E-5μl；
4 G+ V& {; w* S2 j$ O5 J' W第八个Ep管中进行了第七次十倍稀释，所得病毒原液为第七个Ep中的1/10，记为1E-6μl；
7 ?6 E) b8 [1 m9 s5 m- {: J) A$ S- q
四、结果
6 A# k! }) _! Y' U$ L4 I1 @) ?3 x
0 |) f1 }8 y6 r" ?# I0 ~慢病毒滴度计算:/ W5 @( q5 q. T" ]" N% Q. o
根据荧光图片中GFP表达情况，在加入1E-6μl病毒原液的孔中观察到2个( P, H+ q& K" @. }
带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度
! T+ e3 o% E2 z. _/ u: t等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，即2/（1E-6）=2E+6，单位为TU/μl,9 @" ?" H$ H, n$ U3 Y
也就等于2E+9TU/ml。按照此方法对四种目的基因慢病毒载体进行滴度测定，结
8 y# L7 g; L5 q& F+ x8 l0 L果如下：: _+ i* I# S' {. ], I: W
Oct4–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml
& m- N% n5 \7 c% \) j$ BSox2–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml$ G! P1 e5 ]2 k7 f$ ]( s
c-Myc–慢病毒载体滴度：1E+9TU/ml* ?" K: H. A: T& S; C( h
Klf4–慢病毒载体滴度:2E+9TU/ml |
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发表于 2011-6-7 21:19
