WB条带丑陋，求鉴定，求指点，煮样不充分orDNA粘稠？

张也行

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8 j% }) h5 Y/ A2 U& P  L& s: o' m/ S( e& l! t- Y* H
直接用280不太准确。BCA其实不是很麻烦的，不到2h就能搞定。

细胞海洋

回复 hndxws 的帖子0 O+ I% a  U0 P* M, [+ r

* M% d8 m3 }: V4 _建议发新帖提问

hndxws

8 l$ I0 P) i5 K4 @5 {- G. \

1 W, w. h% ^0 N* \我遇见的问题也很郁闷。用的一、二抗体全是昨天的，而且昨天的条带都是好好的，今天跑出来就成这样了。好像显色都反向了，听人说这是因为二抗的HRP太多造成的，也有人说，这是封闭不好造成的。但是我觉得在我的实验里都不存在这些问题。我是用5%脱脂奶粉封闭了一个多小时，而且二抗昨天用没问题，请专家帮分析一下原因，最近这样的情况我遇见好几次了，太郁闷了。

7ubo

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  z  R8 s" F1 N% h- e/ T; ^" q! _% ^1 ]
每个孔上20ul。9 ?8 ~8 V0 r% q& X$ \; R2 K. e
煮20-30分钟不会使蛋白降解吗？100度吗？

zhenhua

: G2 z9 C0 Q! u1 E$ U
. \2 h- _0 w# M+ @呵呵，怎么能说自己的data很丑陋呢？
, }! C( Y3 ^, A/ K% M, g6cm的293T用200ul loading buffer裂解。那你每个泳道上了多少ul呢？; E: x/ r/ X' j" L( v, L* B8 w
如果不定蛋白量得话，每个泳道上50000-100000个细胞。
# q. }. B: A- t. a还有，你的样品很黏，条带拖尾，说明有很多DNA，而且DNA没有充分打断。. u+ a& {! Q. ?  Q& v( Y2 ?
这种情况，我一般要把样品煮20-30min，把DNA都打断了。你也可以试试超声的。
( i" I- a* N- T- S  ^最简单的方法是，每个泳道上50000-100000个细胞的量，样品煮20-30min.

7ubo

回复 aminhair 的帖子; x' o% ~! A( G: Q6 u
/ Z5 {* o* d3 ^. V
谢谢，自己做的

aminhair

定量有专门的试剂盒的。可以方便使用。分光光度计定量偏差会很大。胶是买的还是自己做的？左面的还可以，右面的有点难看哦。电流或者电压调小一点，慢点电泳。

7ubo

回复 shuixiao 的帖子
, p: t# w3 q8 b& D+ C
( D& z4 `2 N% H3 r6 X% w用什么方法定量？BCA？不会很麻烦吗？据说还要先作标准曲线。有没有简单一点的方法？直接测280？我用的是绿色荧光二抗，奥德赛扫膜。

shuixiao

不知道你是用的什么显色方式？

shuixiao

蛋白浓度过高    每个孔道的上样量不应该超过60ug       过高的话 可能在煮沸的时候出现凝集        建议先定一下量